杀菌剂生物测定技术.ppt

1、第三章杀菌剂的生物测定技术、杀菌剂的生物测定方法、供试菌株线虫的生物测定方法、杀菌剂的盆栽试验、杀菌剂的田间药效试验。杀菌剂室内生物测定的主要内容是作用于细菌、真菌或其他病原微生物，并根据其效果判断杀菌剂的毒性。或对植物施用杀菌物质，观察和比较疾病的发生或严重程度来判断药物的效果。供试病原菌应具有分类代表性，应是易培养、多代繁殖不易产生变异的重要农业植物病害的病原菌。1.待测菌株，番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒炭疽病菌、玉米轮纹病菌、苹果溃疡病菌、二倍体分生孢子菌、普通待测菌株、稻瘟病菌、玉米赤霉病菌、玉米赤霉病菌、玉米大斑病菌、棉花枯萎病菌、枯草芽孢杆菌、大白菜1从大量合成化合物2中筛选出

2、可用作杀菌剂的化合物，以寻找治疗特定植物病害的有效药物，因此有必要比较杀菌剂3的毒性，研究杀菌剂2的作用方式和机理。杀菌剂生物测定法的应用，4杀菌剂抗性研究，5杀菌剂复配与配方研究，6杀菌剂抗雨水冲刷能力及残留效应研究，7部分杀菌剂(特别是农用抗生素)的微量分析，孢子萌发法，管碟法，有毒培养基培养法，滤纸法，抑菌圈法，孔板法，生长率法，最小浓度法，叶碟法，第三，室内杀菌剂的主要生物测定方法，孢子萌发法是测定杀菌剂毒性最古老、应用最广泛的方法。早在1807年。Prevost采用了这种方法，经过许多学者的改进，使其更加规范和合理。1。孢子萌发法，原理：将待测药物附着在载玻片或其他平面上，然后将待测

3、病原体的孢子悬液滴在其上(或将悬液与药液混合后滴在载玻片上)，在保温条件下培养一定时间，然后在显微镜下观察，根据孢子萌发率判断杀菌剂的毒力。孢子萌发法的突出优点是速度快，当天即可获得结果，特别适合筛选保护剂。以病原菌孢子为指标测定杀菌剂的毒力。孢子溶液与不同浓度的药液混合，恒温恒湿培养一定时间后，即可检查孢子的发芽率。一般来说，在低倍显微镜下随机检查200个孢子。孢子萌发标准，孢子萌发率(%)，萌发孢子数/检验孢子数X100。如果对照组中超过20%的孢子不能发芽，应该重做。对照发芽率处理的发芽率抑制孢子发芽率(%)X100对照发芽率，并计算抑制率，将孢子发芽抑制率转化为概率值y；药物浓度用对数

4、表示为x，线性回归得到回归方程Ya bx，可得到LC50和LC95。LC50和LC95，孢子萌发法只适用于产孢真菌。一般检测的病原菌有晚疫病菌、稻瘟病菌、玉米赤霉病菌、玉米大斑病菌，孢子萌发法的适用范围为2。有毒培养基培养法，有三种方法：(1)抑菌圈法，(2)生长率法，(3)最小浓度法。基本原理是通过各种方法(管碟法、滤纸片法和孔碟法)使液体药物与培养基在接种了测试细菌的卷心菜培养基(通常在培养皿中)的表面接触。经过一定时间的恒温培养，由于药物的渗透和扩散，使施药部位周围的细菌被杀死或生长受到抑制，根据抑菌圈的大小，比较了不同杀菌剂的毒力。(1)抑菌圈法的原理，抑菌圈法的优点，准确度高，操作简

5、单，抑菌圈法的缺点，溶解度扩散，抑菌圈法的优点和缺点，抑菌圈法示意图，含孢子培养基，不同浓度的药液，根据在甘蓝培养基表面施药的方式，抑菌圈法，(1)将供试品用无菌蒸馏水配制成一系列梯度浓度，一般为57个浓度。(2)配制一定“浓度”的试验菌悬液(孢子悬液适用于真菌)，在低倍放大(15X10倍)下，浓度约为每视野80-100个孢子。管碟法也被称为牛津杯。(3)当培养基冷却至50左右(根据经验估算)时，迅速吸收10毫升菌液并加入培养基中。充分混合后，将其倒入已灭菌的培养皿中，准备一个含有细菌的培养皿。(4)在每盘培养基上以适当的间隔放置6个不锈钢细管(牛津杯，外径8.00.1毫米)。内径为6.00.

6、1毫米，高度为10.00.1毫米)，其中一管作为对照，另外五管由五种不同浓度的药液制成，在合适的温度下培养一段时间，然后取出用十字法测量抑菌圈的直径。抑菌圈法的示意图，上述操作应尽可能在无菌条件下进行，以防污染。手术室的温度应该在2628左右。如果室温太低，约50的培养基在操作过程中会迅速凝结，不可能用平交法测量抑菌圈直径并消除误差。注意事项：(1)准备不同浓度的药液；(2)制备孢子悬浮液；(3)制作含孢子平板，滤纸法，前三步与上述管碟法完全相同。(4)将灭菌后的圆形滤纸片(直径为0.6或0.8厘米)放入不同浓度的药液中，1分钟后取出，放在含有真菌孢子的培养基上，每盘放6片(五种浓度各一片，另

7、一片为对照照片)，恒温培养一定时间，测量抑菌直径。每张滤纸片的间距应合适，以防止形成的抑菌圈水平放置，更快更准确，放下后不能再移动。用十字法测量抑菌圈的直径。注意事项：用无菌打孔机在固化的含孢子培养基上直接打一个圆孔，在圆孔中滴入一定量的药液，恒温培养后测量抑菌圈的大小，比较杀菌剂的毒性。平板法，主要有以下几个方面：1 .对测试细菌的要求。在更广泛的杀菌剂毒性测定中，对菌株的要求不必太严格，只要它们易于在培养基中培养且抑菌圈清晰，就可以使用。影响抑菌圈法检测结果的因素，特别是在寻找特定疾病的有效控制药物时，实际上不可能选择被测细菌，但如果采用水平扩散法进行生物定量测定，如抗生素效价测定，则被测

8、细菌必须满足以下要求：合适的敏感物质例如，由于大多数抗生素具有一定的水溶性，抑菌圈法被广泛应用于抗生素的研究和生产中。然而，相当多的杀菌剂不溶于水，所以它们的扩散性不好。要使用这种方法，必须用适量的乙醇或丙酮溶解它们，然后用水稀释至所需浓度。有效且水溶性好，将不同浓度的药液与热培养基混合，用该有毒培养基培养疾病，并根据病原菌的生长进程判断药物的毒力。(2)生长率法有两个原则：菌落达到一定大小所需的时间和一定时间内菌落的直径。病原菌生长的表达方法，优点：操作简单，适用范围广，对乳油、水剂、可湿性粉剂等有良好的重复性。只要操作仔细，就能获得可靠的结果。生长率法的优缺点：对供试菌株要求严格，易培养，

9、生长快，边缘整齐，产孢慢，是农业生产中的重要致病菌。要求被测试剂具有一定的耐热性，受热不易分解。(1)制备菌饼：在无菌条件下，用无菌打孔机将被测菌株边缘的菌块切掉；(2)制备有毒培养基：将被测药物稀释到一系列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热培养基中，混合均匀浓缩后是有毒的培养基。生长速率法：(3)菌饼的移植将菌饼的反面(有菌丝的一面向下附着在培养基上)移植到有毒的培养基平板上，一个培养皿最好连接一个菌饼。(4)测量菌落直径，恒温培养预定时间，取出培养皿测量菌落直径。每个菌落的直径在十字架上测量两次。生长速率法示意图、菌饼、含药培养基、菌饼、毒性培养基、纯生长菌落直径、菌饼直径控制的纯生长

10、处理的生长抑制率、X100控制的纯生长抑制率、计算公式，将计算出的EC95处理的抑制率(浓度)转化为概率值，并以对数表示浓度为图。在广泛比较几种杀菌剂的毒性时，可采用最低抑制浓度法计算毒性方程。(3)最小抑制浓度法。最小浓度法的基本原理是将药物与培养基按等比或等差级数浓度混合，然后接种到试验菌中。经过一定时间的恒温培养，找到了“终点”(明显抑制试验菌生长发育的最高稀释倍数，即最低抑制浓度)的浓度。通过比较几种不同药物的最佳抑制浓度，我们可以比较它们的毒性。显然，最低的抑制浓度具有最大的毒性。根据培养基是固体还是液体，最小抑菌浓度法分为液体培养基稀释法和固体培养基稀释法。取几个已灭菌的试管，按顺

11、序编号，在每个试管中加入适合被测细菌生长的液体培养基Nml，然后在第一个试管中加入一定浓度的测试液Xml，充分混合后将第一个试管中的Nml放入第二个试管中，充分混合后将Xml加入第三个试管中，直到最后一个试管没有加入药液作为对照。从倒数第二个试管中取出Xml并丢弃，这样就可以将一系列浓度的顺序加倍。液体培养基稀释法，在每个试管中加入一滴试验菌悬液，在最佳温度下培养一定时间，并取出观察“终点”,该点一般以浊度为准，即在一定数量的试管以下没有出现明显的浊度将每种浓度的Xml分离到50毫升灭菌三角瓶中，加入灭菌冷却的培养基Yml至60左右，立即摇匀，倒入培养皿中凝固。用接种环蘸试验菌液进行划线培养，

12、观察一定时间后最高稀释倍数，即最低抑制浓度。固体培养基稀释法、接种饼，如果它不能生长，这个浓度是最低的抑制浓度、交叉接种细菌，它就不能生长，这个浓度是最低的抑制浓度，叶盘法相对简单，可以在室内进行，这比孢子萌发法和有毒培养基培养法更接近实际生产，并可视为盆栽试验的过渡阶段。3.叶碟法，叶碟法的基本原理是用不同浓度的化学物质处理易感染试验菌的植物叶片(如蚕豆叶片)，然后将一片培养好的试验菌菌丝体(如立枯丝核菌)放在叶片上，保持一定时间的湿润，检查病斑面积，从而测出试验化学物质的毒性。还有一种叶盘漂浮法，其原理是将易感染被测细菌的植物叶片(如黄瓜叶)制成直径为1.5厘米的叶盘，将它们漂浮在不同浓度

13、的药液中，将被测细菌(如黄瓜霜霉病)的孢子悬液定量滴在叶盘上，在光照下培养一定时间，调查病斑面积。叶盘浮动法，4。杀线虫剂生物测定技术，被测线虫：番茄根结线虫，南方根结线虫，马铃薯茎线虫，破坏线虫。然而，如果为某种线虫选择了合适的杀线虫剂，它只能用作指示生物。杀线虫剂的生物测定方法根据制剂的性质可分为两类：(1)非熏蒸剂测定方法(2)熏蒸剂测定方法：将蒸馏水稀释至57个梯度浓度，将1.5毫升上述药液加入一个小玻璃皿(高1厘米，直径2厘米)，每种浓度重复3个皿，然后加入1.5毫升蒸馏水，用清水冲洗分离出的线虫，并将其挑入小皿。1520皿/皿将盛有药液和线虫的小皿放入衬有湿滤纸的大培养皿中，在24

14、25培养箱中放置24小时或48小时，然后取出，在双目显微镜下观察线虫的存活情况。在非熏蒸剂的生物测定中，不动的、细长的线虫或带有弯曲的骨状和黑色颗粒的蠕虫通常被认为是死线虫。1.触摸方法2。染色方法、线虫死亡判断标准、12345CK、线虫死亡率X100。浓度作为对数值，线虫死亡率转化为概率值。用农药毒性试验方法计算LC50或LC95，然后进行毒性比较。根据计算公式，基于熏蒸的杀线虫剂毒性试验与农药相似。将滤纸贴在0.33升熏蒸瓶的瓶壁上，在瓶底放一个小玻璃皿(高1厘米，直径2厘米)，向皿内注入蒸馏水使水位达到2毫米左右，放入1520只待测线虫，在瓶底放一张滤纸片(1X 3毫米)，用微型注射器将待测试剂加入滤纸上。测定需要设定五个浓度，加入二溴氯丙烷，设定100、50、25、12、6mgL和非药物对照，并重复三次。24时25分熏蒸24小时，检查线虫的死亡率。(2)熏蒸剂、线虫、滤纸片的毒性试验；(5)杀菌剂、化学药剂(杀菌剂)、病原菌的盆栽试验、室内生物测定、杀菌剂的盆栽试验、盆栽和钵栽幼苗的生物测定是研究杀菌剂的有效方法之一。盆栽试验方法克服了体外对病原体无效和体内有效的化合物的遗漏。同时，盆栽试验方法更接近现场实际情况，所得数据对指导实际生产具有较高的参考价值。此外，盆栽试验所用材料易得，条件易控制。在目前