蛋白质等电点的测定.ppt

1、蛋白质等电点的测定，主要内容：(1)了解蛋白质的两性解离特性。(2)学习如何确定蛋白质的等电点。蛋白质的解离性，是两性电解质。蛋白质溶液中存在以下平衡：蛋白质的等电点、蛋白质分子的解离状态和程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的酸碱度达到一定值时，蛋白质颗粒上的正电荷和负电荷数量相等。在电场中，蛋白质既不移动到阴极也不移动到阳极。此时，溶液的酸碱度被称为这种蛋白质的等电点。不同的蛋白质有其特定的等电点。在等电点，蛋白质的物理和化学性质发生变化，这可以用来确定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是在溶液的溶解度最低时测量溶液的酸碱度。等电聚焦电泳用于测量净电荷为零时的酸碱度浊度。分光光度法是基于蛋白质和离

2、子交换的作用。首先，当溶解度最低时，测量溶液的酸碱度。实验原理：通过观察酪蛋白在不同酸碱度溶液中的溶解度，可以确定其等电点。用乙酸和柠檬酸钠(乙酸钠混合在酪蛋白溶液中)制备不同酸碱度的缓冲溶液。将酪蛋白加入缓冲溶液后，沉淀最多的缓冲溶液的酸碱度为酪蛋白的等电点。设备：水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架和研钵试剂：(1)0.4克酪蛋白醋酸钠溶液(2)1.00摩尔l醋酸溶液(3)0.10摩尔l醋酸溶液(4)0.01摩尔l醋酸溶液、实验设备和试剂：(2)向上述试管中加入1毫升酪蛋白乙酸钠溶液，加入一个试管并摇动一个试管。此时，试管1、2、3和4的酸碱值依次为5.9

3、、5.3、4.7和3.5。观察到混浊度。静置10分钟后，观察浊度。最浑浊的试管的酸碱度是酪蛋白的等电点。等电聚焦电泳的原理：1)有一种两性电解质：它的等电点逐渐变化，差异很小，在电场作用下形成一个逐渐连续的酸碱度梯度，因此在电泳介质中加入这种物质可以使介质的酸碱度由酸性逐渐变为碱性。在电场的作用下，两性电解质载体根据其等电点从阳极到阴极形成一个连续稳定的酸碱度梯度。聚丙烯酰胺凝胶用作电泳支持介质，两性电解质载体加入凝胶中。在电场的作用下，蛋白质以这种酸碱度梯度在凝胶中游动。当它们迁移到pI值时，它们不再游泳，而是集中在狭窄的区域。第三章。实验试剂和仪器1)两性电解质2)30%丙烯酰胺溶液3)T

4、EMED 4)10%过硫酸铵溶液5)负缓冲液：0.1M氢氧化钠正缓冲液：0.1M磷酸或硫酸固定液：10(重量比)三氯乙酸染色液脱色液蛋白质等电点标准电泳槽，图聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(a为正面，b为横截面)。四.操作方法1。凝胶柱的制备(1)将玻璃管的一端插入橡皮帽中(2)配置表10毫升7.5%凝胶制备试剂名称体积(毫升)凝胶储存溶液2.5两性电解质载体0.5蒸馏水6.75 10%过硫酸铵0.05 10%TEMED 0.1蛋白质混合样品0.1，然后在真空干燥器中抽吸10分钟；(3)将制备好的凝胶溶液加入事先用细长滴管准备好的玻璃管中，直到它离开上端1厘米，然后用注射器缓慢加水至3-5毫米的

5、高度。电泳将装有凝胶的玻璃管固定在电泳槽上槽的孔中(安装时，确保凝胶管垂直，橡胶塞孔密封)。在上罐中加入0.1摩尔/升氢氧化钠溶液，在下罐中加入0.1摩尔/升磷酸盐缓冲溶液。连接电泳仪，打开电源，调节电压至160伏，整夜聚焦，当电流降至0时关闭电源。3、剥离电泳后，取下凝胶管，用蒸馏水清洗两端的电极溶液，并标记阳性将装有水的注射器的长针插入凝胶和玻璃管壁之间，在压水的同时慢慢旋转玻璃管，向前推动针，同时注射水。玻璃管的内壁通过水压和润滑力与凝胶分离，凝胶条可以流出。4.将凝胶条固定并染色，放在干净的玻璃板上，用直尺测量固定前凝胶条的长度。将其放入带盖的试管中，加入固定液。固定20分钟后，倒出固定液，用脱色液冲洗两次，染色1小时，用蒸馏水冲洗几次，用脱色液脱色，直至蛋白带清晰，并测量蛋白带与正极端之间的距离。5.蛋白质带聚焦位置的计算蛋白质带聚焦位置和凝胶带正端之间的实际长度如下：蛋白质带中心和凝胶带正端之间的距离在染色前和染色后是固定的；3.浊度和分光光度法，当溶液的酸碱度与蛋白质的等电点相同时，静电荷为0；当溶液的酸碱度大于蛋白质的等