动物细胞培养和核移植技术.ppt

1、动物细胞工程常用的技术 动物细胞培养：其他动物细胞工程技术的基础。 动物细胞核移植 动物细胞融合 生产单克隆抗体等,应用：烧伤病人皮肤移植。抗毒血清（抗体的获得）,用培养的人细胞构建的人造皮肤,一动物细胞培养,概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,原理：细胞增殖,培养基：液体,动物体细胞大都生活在液体的环境,相关概念 选材： 动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。 分散成单个细胞（消化）：在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋

2、白质。动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,补充：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白。 动物细胞生长特性： 细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,原代培养：将动物组织消化后的初次培养。从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中

3、取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。 补充：原代培养的细胞生长，繁殖一定时间后，会出现接触抑制现象，细胞就会停止分裂增殖，因此需要重新用胰蛋白质酶等处理，进行分瓶扩大培养，即传代培养。,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶处理分散成单个细胞,10代细胞,原代培养,无限传代,部分细胞的细胞核型可能发生变化,遗传物质未改变，保持正常的二倍体核型,细胞株：传代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在

4、培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,细胞株,细胞系,细胞增殖,无限传代,去掉组织间蛋白,过程：,动物细胞培养不能 最终培养成生物体,补充：1为何细胞在培养瓶中贴壁生长？ 细胞有接触抑制的现象。 2为何要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上 脱离下来，为何要搅拌？ 分散成单个细胞便于从培养液中获得营养， 排出代谢废物，利于继续培养 3比较动物和植物组织培养所用的培养基的成分。都有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素

5、等 动物细胞培养液中还需加入动物血清、血浆等天然成分。,动物细胞培养的条件 1无菌、无毒的环境 （对培养液和所有培养用具进行无菌处理，添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染，定期更换培养液，以清除代谢产物，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。）,2营养 细胞体外培养所需营养物质与体内基本相同。（葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、维生素、动物血清等。） 合成培养基：按营养物质种类及数量严格配制而成的培养基。 天然培养基：由于科学家对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，需加入血清，血浆等一些天然成分。,补充：为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 血清中含有蛋白质、氨

6、基酸、葡萄糖、激素等多种营养； 还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，一般需添加10%20%的血清。,3温度和PH 36.50.5度, 7.2-7.4 4气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,获得细胞或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,动物细胞培养应用 大规模培养生产生物制品（病毒

7、疫苗、干扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,二动物体细胞核移植技术和克隆动物 动物细胞与植物细胞不同，动物细胞的全能性会随着动物细胞分化程度的更高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物体细胞克隆动物，实际是通过核移植来实现。动物细胞的细胞核具有全能性。,概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动

8、物称为克隆动物。 类型：胚胎细胞核移植，体细胞核移植。其中胚胎细胞分化程度低，恢复全能性容易，核移植更容易成功。 受体细胞：M期的卵母细胞 原理：动物细胞的细胞核的全能性。,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,取供体细胞,取卵母细胞,供体细胞培养,培养到 M中期,卵母细胞去核,供体细胞注入去核的卵母细胞,供体核进入受体卵母细胞,重组胚胎,代孕母牛,生出与供体遗传物质基本相同的个体,过程：,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程,2、保护濒危物种,3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植,4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,体细胞核移

9、植技术的应用前景及克隆动物的研究意义：,体细胞核移植技术存在的问题： 1许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。 2成功率非常低 3克隆动物食品的安全性问题。,讨论： 1在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？ 为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,2用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？ 培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可

10、能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,3你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？ 绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。 此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,思考与探究

11、 2动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？ 动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,31997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢

12、辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。 该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？ 从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显

13、微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。 研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,1.下列哪项属于克隆（ ） A将鸡的某个DNA片

14、段整合到小鼠的DNA分子中 B将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C将鼠骨髓瘤细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤 细胞 D将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系,D,2.（多选）美国杜克大学医疗中心的一个研究小组利用 成年猪的动脉血管细胞和模拟胚胎环境的新型生物反应 器,成功地在实验室里培育出新的动脉血管，这种血管的 外形和功能都与真的血管一样,这一研究成果是生物组织 培养领域的重大进展。下列关于以上技术的叙述中，正 确的是（ ） A属于“克隆” B可能要利用去核卵细胞 C关键是激发血管细胞的全能性 D关键是激发血管细胞发育成血管的潜能,ABD,3 .从母羊甲的体细胞中取出细胞核，注入到母羊乙去掉 核的卵细胞中，融合后的细胞经卵裂形成早期胚胎，再植 入到另一只母羊丙的子宫内，出生小羊的大多数性状 （ ） A、难以预测 B、像甲 C、像乙 D、像丙 4.生物技术的发展速度很快，已灭绝生物的“复生”将不再 是神话。如果世界上最后一只野驴刚死亡，以下较易成功 “复生”野驴的方法是 （ ） A将野驴的体细胞取出，利用组织培养技术，经脱分 化、再分化，培育成新个体 B将野驴的体细