2.2.尿素上课2.ppt

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,尿素是怎样被植物吸收的？,尿素 CO(NH2)2,只能被分解为NH3才能被植物吸收利用,产生脲酶的细菌即为能分解尿素的细菌,任务1：怎么从土壤中分离出它们呢？,二、研究思路,阅读课本P21，感悟科学家寻找 耐高温的DNA聚合酶给你的启示。,（一）筛选菌株,方法： 人为提供有利于目的菌株生长 的条件（包括营养、温度、pH等）， 同时抑制或阻止其他微生物的生长。,4,固体培养基,液体培养基,有 无 凝固剂琼脂,分离 鉴定,工业 生产,（1）按物理性质划分：,培养基,5,天然培养基,合成培养基,化学成分不恒定的天然有机物,如：牛肉膏蛋白胨培养基

2、、马铃薯培养基,化学成分完全了解的物质配制而成的培养基,如：高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定,（2）按化学成分划分：,6,基础培养基,鉴别培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质,将某种类微生物从混杂的微生物群体中分离出来,用于鉴别不同类型微生物的培养基,选择培养基,（3）按用途划分：,7,几种选择培养基,加入青霉素的培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌,不加氮源的无氮培养基,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,分离自养型微生物,根据这一思路，你能否将土壤中分解 尿素的细菌分离出来，说说你的思路。,利用以尿素为唯一氮源 的培养基进行筛选。,能。只有产生 脲酶的细菌才能利用尿素作

3、为氮源而生存。,此培养基 能否筛选 出产生脲 酶的细菌？ 为什么？,KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用 蒸馏水定容到1000mL。,（一）筛选菌株,1、利用选择培养基筛选,在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,选择培养基：,1、利用尿素作为唯一氮源的培养基 分离出的微生物 只是一种细菌吗？ 都是能分解尿素的微生物吗？,思考：,不是，有多种。,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿

4、素。,不一定。因为有些微生物可以利用 其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。 还有固氮微生物。,因此，还需借助生物化学方法 对分离的细菌作进一步的鉴定。,都是能分解尿素的微生物吗？,2、请你提供一种方法，判断分解 尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。,思考：,方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂,接种培养该细菌，若 指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。,3、要验证以尿素为唯一氮源的培养基 对土壤中的细菌确实具有选择作用，你 该如何设计实验。,思考：,思路：制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基为实验组，接种等量的从同一土壤中采集的细菌，培养、计数并比较两组培养基上的菌落

5、数。,思考2： 统计每克土壤样品中 究竟含有多少这样的细菌？,计数法,活菌计数法 显微镜直接计数法 比浊法 滤膜法,1.稀释涂布平板法（活菌计数法） 原理：当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中含有多少活菌。（即一个菌落代表原先的一个单细胞。）,（2）计算：每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,17,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲

6、同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板） 乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,18,注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到 三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养 计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般 以三个稀释度中的

7、第二个稀释度所出现的 平均菌落数在50个左右为最好。,2、显微镜直接计数,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,讨论,对同一细菌培养液样品分别用显微镜 直接计数法和稀释涂布平板法测定其 菌体数量，你认为两种方法所测数据 有何差异？,设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的 。为了排除培养基是否被杂菌污染了，需培养 的培养基作为空白对照。,设置对照,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基

8、中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),非测试因素,可信度,未接种,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,23,谢谢合作！,二、实验设计 .土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3c

9、m左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。,25,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,.制备培养基：,26,（三）样品的稀释,应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。依次等比稀释至106稀释度 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。,27,分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是 ，其目的是保证获得 的平板。 细菌稀释度一般为

10、 ， 放线菌稀释度为 ， 真菌稀释度为 。,不同微生物在土壤中含量不同,菌落数在30300之间、适于计数,104、105、106,103 、 104、105,102、103、104,28,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,P24旁栏思考

11、题,29,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,选取适合的稀释范围分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,30,计算公式：,每克样品中的菌株数 =（CV）M,31,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2

12、528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,32,将涂布好的培养皿放在30 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。 比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,33,在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面,34,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,35,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,36,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,3

13、7,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,38,思考在研究未知微生物时务必规范操作，以防被 感染，实验后一定要洗手。,致病微生物,三、操作提示,阅读P25页,1、无菌操作 2、做好标记 3、制定时间,39,四.结果分析与评价 1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,40,41,42,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进

14、一步的鉴定?,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,3. 怎样鉴定某细菌能够分解尿素？,43,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,3. 怎样鉴定某细菌能够分解尿素？,借助生物化学的方法,44,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,借助生物化学的方法,CO（NH2）2 + H2O,CO2+2NH3,脲酶,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,45,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,借助生物化学的方法,CO（NH2）2 + H2O,CO2+2NH3,脲酶,通过检测培养基pH变化来判断,2. 怎样

15、判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,46,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,3. 怎样鉴定某细菌能够分解尿素？,借助生物化学的方法,通过检测培养基pH变化来判断,47,五 课题延伸,怎样对分离的菌种作进一步的鉴定?,2. 怎样判断细菌分解尿素的化学反应是否发生？,3. 怎样鉴定某细菌能够分解尿素？,借助生物化学的方法,通过检测培养基pH变化来判断,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指 示剂将变红 ，说明该细菌能够分解尿素。,48,请根据以上配方，回答下列问题： (1)该培养基含有微生物所需要的_类营养 物质。其中最主要的碳源是_，氮源是 _。 (2)该培养基按物理性质划分是_培养基； 按培养基的作用划分是_培养基。,4,葡萄糖,尿素,固体,选择,例：下面是分离分解尿素的细菌所用的培养基配方,49,(3)该培养基具有选择作用的原因是 。,该培养基中，唯一的氮源是尿素，只有能分解 尿素的