双水相萃取脂肪酶课件.ppt

1、双水相萃取脂肪酶,2,双水相萃取脂肪酶,3,双水相萃取脂肪酶,概述：本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术，探究了双水相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果。,概述,4,双水相萃取法是利用生物大分子物质在由高聚物/高聚物/水或者高聚物/无机盐/水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离的。 现在研究最多的双水相体系有高聚物/高聚物以及高聚物/无机盐体系，常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等，无机盐主要有磷酸盐、硫酸盐等。本实验所采用的就是PEG/硫酸盐体系，,概述,5,黄酮类化合物的提取和分离,概述,与传统的蛋白质分离提纯方法相比， 双水相萃取方法具有

2、很多优点： 体系含水量高，可达80以上； 蛋白质在其中不易变性； 界面张力远远低于水有机 溶剂两相体系的界面张力， 一般为0.510-4mN*m-1 ，有助于强化相际间的质量传递；,6,黄酮类化合物的提取和分离,为了得到适合的两相配比，就要通过绘制相图来进行分析，相图的绘制就是通过调整两相比例，得到能够分相的临界点，从而得到相图。 脂肪酶经过双水相的初步分离后，还要通过凝胶过滤的方法对其进行进一步的分离和纯化，从而达到更高的纯度。但是经过双水相后，体系中有大量的PEG（脂肪酶主要分配在PEG相）从而不能直接经过凝胶过滤，还需要采取一定手段去除过量的PEG，可以采用PEG沉淀的方法或者反萃取来去

3、除多余的PEG。 本实验采用的是PEG/（NH4）2SO4体系和SDS/CTAB体系两种双水相。PEG/（NH4）2SO4体系是较为常用的一种双水相体系， SDS/CTAB体系是一种表面活性剂双水相体系，,实验原理,7,黄酮类化合物的提取和分离,实验材料：假单胞菌脂肪酶（由假单胞菌发酵制备） 实验仪器：紫外可见分光光度计，离心机，乳化机，恒温摇床，恒温水浴锅，PH计,实验用品,8,黄酮类化合物的提取和分离,PEG1000、（NH4）2SO4、十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、橄榄油、2%聚乙烯醇（PVA）溶液、糊精、蛋白胨、 K2HPO43H2O，MgSO47H2O，

4、0.05mol/L NaOH溶液，酚酞指示剂，EDTA,pNPP,乙腈,实验药品,实验药品,9,多呈黄色，且颜色与分子中的交叉共轭体系(发色团)及助色团有关,黄酮苷均有旋光性，且多为左旋。游离的二氢黄酮、二氢黄酮醇、二氢异黄酮和黄烷醇等具有旋光性。其余的游离黄酮则无旋光性,在紫外灯光下 普遍具有荧光,10,学习目标,1,双水相相图的制作,熟练进行黄芩、葛根、银杏叶中黄酮的提取分离操作； 能进行补骨脂、槐花中黄酮的提取分离操作。,实验方法,11,黄酮类化合物的提取和分离,药 材,水或醇-水，加热提取,提取液,浓缩，加3-4倍醇,醇水液,沉淀（水溶性杂质）,浓缩，回收醇，加水,水 液,依次用石油醚

5、、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,石油醚层,氯仿层,乙酸乙酯层,正丁醇层,水层,叶绿素等脂 溶性成分,黄酮苷元,大极性苷元 小极性的苷,黄酮苷,多糖 蛋白质,原理： 利用黄酮类与其它杂质极性 不同，选不同溶剂进行萃取,溶剂萃取法,12,黄酮类化合物的提取和分离,原理：酚羟基与碱成盐，溶于水；加酸后析出 碱： 常用Ca(OH)2，即石灰乳(石灰水),碱提酸沉法,药材,碱水液,H+,OH-,沉淀 （黄酮苷，苷元）,水液 （水杂，M+）,13,黄酮类化合物的提取和分离,优点 A：使含酚羟基化合物成盐溶解。 B：使含羧基杂质（果胶、粘液质、蛋白质等） 形成钙盐沉淀。 注意 a：提取时，碱液浓度不宜过高。

6、b：加酸酸化时，酸性也不宜过强。 应用：芦丁和槲皮素等的提取、分离和鉴定。,碱提酸沉法,14,黄酮类化合物的提取和分离,原理：活性炭吸附黄酮苷类化合物 用途：主要用于含量较高的黄酮苷类的精制,活性炭吸附法,甲醇粗提液,活性炭,黄酮-活性炭,沸水,沸甲醇,7酚/水,15%酚/醇,黄酮苷,15,黄酮类化合物的提取和分离,极性 氢键 分子大小（量） 酸性 特殊结构,硅胶 聚酰胺 凝胶 梯度pH萃取法 金属盐络合法,柱色谱法,分离方法,16,黄酮类化合物的提取和分离,硅胶是一种高活性吸附材料，其化学分子式为mSiO2nH2O 应用范围： 主要分离小极性和中等极性的化合物，应用最为广泛。 异黄酮、二氢黄

7、酮（醇）、高度甲基化（乙酰化）的黄 、 酮及黄酮醇。 多羟基黄酮、黄酮醇及其苷类：硅胶加水去活化。 吸附规律： 极性大吸附能力强 e g ： A 苷元 B 二糖苷 C 单糖苷 Rf：A C B,硅胶柱色谱,17,黄酮类化合物的提取和分离,原理：氢键吸附（作用） 洗脱规律：（先后） 母核上游离羟基增加，越难于洗脱。 羟基数目相同时，有缔合羟基 无缔合羟基 苷元相同：三糖苷 双糖苷 单糖苷 苷元 不同类型黄酮类化合物的洗脱先后顺序为： 异黄酮二氢黄酮醇黄酮黄酮醇 分子中芳香程度高、共轭双键多，则聚酰胺对其的吸附力强，故难于洗脱。 应用范围：适合各种类型的黄酮类化合物，包括苷、苷元、查耳酮及二氢黄酮

8、。,聚酰胺柱色谱,18,正相与反相色谱,硅胶 固定相（硅醇） 流动相（醇）极性时为正相 聚酰胺 固定相（聚酰胺脂肪链） 流动相（醇水）极性时为反相,槲皮素对照品,槲皮素,芦丁,芦丁对照品,槲皮素对照品,槲皮素,芦丁,芦丁对照品,聚酰胺TLC,硅胶TLC,黄酮类化合物的提取和分离,19,黄酮类化合物的提取和分离,常用型号：Sephadex-G和Sephadex-LH20 原理：吸附作用和分子筛 对游离黄酮，主要是吸附作用, 吸附程度取决于游离酚羟基的数目，苷元的羟基数目越多，越难洗脱。 对黄酮苷，主要是分子筛原理, 洗脱时按分子量由大到小先后洗脱下来。 常用洗脱剂： 碱性水溶液（0.1mol/L

9、 NH4OH），盐水溶液(0.05mol/L NaCl) 醇及含水醇，如甲醇，甲醇-水，乙醇等。 其它溶剂：含水丙酮、甲醇-氯仿(凝胶会膨胀， 体积变大)。,葡聚糖凝胶柱色谱,20,黄酮类化合物的提取和分离,规律： 苷元的羟基数越多，越难以洗脱。 吸附作用 苷的分子量越大,其上联结糖的数目越多,容易洗脱。 分子筛原理 苷比苷元先洗脱。,葡聚糖凝胶柱色谱,21,黄酮类化合物的提取和分离,原理： 黄酮类化合物具有酸性、且不同数目和不同位置的酚羟基的酸性强弱不同。 适用范围：适用于分离酸性强弱不同的黄酮苷元,酸性： 7,4-OH 7-或4-OH 一般酚OH 5-OH,溶于 5%NaHCO3,溶于 5

10、%NaCO3,溶于 0.2%NaOH,梯度pH萃取法,溶于 4%NaOH,22,黄酮类化合物的提取和分离,乙醚液 （脂杂）,乙醚液,乙醚液,乙醚提取液,乙醚液,碱液(3或5-OH黄酮),碱液(一般酚OH黄酮),碱液(7,4-二OH黄酮),碱液(7或4-OH黄酮),5% NaHCO3,5% Na2CO3,0.2% NaOH,4% NaOH,梯度pH萃取法,23,黄酮类化合物的提取和分离,原理：利用分子中某些特定官能团性质进行分离 具有邻二酚羟基的成分，用醋酸铅沉淀 不具有邻二酚羟基的成分，用碱式醋酸铅沉淀 具有邻二酚羟基的黄酮类化合物还可以与硼酸反应形成溶于水的硼酸络合物，可以与不具有邻二酚羟基

11、的其它黄酮类化合物分离。,金属盐络合法,24,第十一章 黄酮类化合物,概 述,1,黄酮类化合物的结构和分类,2,黄酮类化合物的理化性质,3,黄酮类化合物的提取和分离,4,黄酮类化合物的检识和结构鉴定,5,25,黄酮类化合物的检识和结构鉴定,一 色谱法的应用二 紫外光谱三 1H-NMR四 13C-NMR五 质谱,概 述,26,黄酮类化合物的检识,颜色：多呈黄色 母核检识： 盐酸-镁粉反应 黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇 四氢硼钠反应 二氢黄酮（醇）类 取代基团检识：锆盐-枸橼酸反应 3-OH、 5-OH黄酮鉴别 氨性氯化锶反应 邻二酚羟基 色谱检识: 硅胶 TLC 聚酰胺TLC 纸色谱（PC

12、）,理化检识,27,黄酮类化合物的检识和结构鉴定,硅胶TLC：用于分析与鉴定弱极性黄酮类化合物。 展开剂：甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1)，苯-甲醇，氯仿-甲醇等。 聚酰胺TLC： 适合于含游离酚OH的黄酮及其苷类的分析。 聚酰胺对黄酮类化合物吸附能力强，大多数展开剂中含有醇、酸或水。 纸色谱（PC）： 适用于各种黄酮类化合物及其苷类的分析。,色谱法,28,黄酮类化合物的检识和结构鉴定,第一相展开采用醇性展开剂 如: BAW、TBA、水饱和n-BuOH 色谱行为: Rf值: 苷元单糖苷双糖苷 一般:苷元在0.70以上，而苷则小于0.7。,分 配 作 用,第二相展开采用水性展开剂 如：26%

13、HOAc水溶液 3% NaCl 水溶液 HOAc:浓HCl:H2O= 30: 3 : 10 色谱行为: 连接糖越多, Rf 越大(0.5); 苷元Rf较小，有的留在原点。,吸 附 作 用,双向色谱,29,黄酮类化合物的检识和结构鉴定,苷元:平面型分子: 黄酮(醇)、查耳酮的Rf小, 几乎留在 原点不动 (Rf 0.02);非平面型分子: 二氢黄酮(醇)、二氢查耳酮的Rf大, 因亲水性较强 (Rf 0.10-0.30)。,纸色谱,纸色谱（PC）：采用双向纸色谱。,色谱检查方法：观察荧光，NH3处理产生明显的色变。AlCl3显色，UV灯下呈亮黄色荧光斑点。,30,黄酮类化合物结构鉴定,一般步骤：

14、1 待测样品在甲醇中的UV光谱。 2 待测样品在甲醇中加入各种诊断试剂后的UV光谱。 诊断试剂：NaOCH3 , NaOAc, NaOAc/H3BO3, AlCl3, AlCl3/HCl 3 苷类水解后的UV光谱。,UV,31,黄酮类化合物的结构鉴定,苯甲酰基 带II：220280nm,桂皮酰基 带I：300400nm,UV,32,两者UV光谱图形相似，但带I位置不同。整个母核上氧取代程度越高，则带I将向长波方向位移（红移）。,不同类型黄酮的UV基本特征,a. b.,黄酮 黄酮醇,33,带II吸收峰为主峰，带I很弱，常在主峰的长波方向有一肩峰。,c. d.,不同类型黄酮的UV基本特征,245-

15、270nm,270-295nm,异黄酮、二氢黄酮 二氢黄酮醇,34,共同特征是带I很强，为主峰 而带II则较弱，为次强峰。带I的位置不同。,不同类型黄酮的UV基本特征,查耳酮 橙酮类,35,不同类型黄酮的UV基本特征,UV,36,诊断试剂在结构测定中的应用,常用的诊断试剂： 甲醇钠 (NaOCH3) 醋酸钠 (NaOCOCH3) 醋酸钠 / 硼酸 (NaOCOCH3 / H3BO3) 三氯化铝 (AlCl3) 三氯化铝 / 盐酸 (AlCl3 / HCl),UV,37,诊断试剂在结构测定中的应用,NaOMe：碱性强，酚OH易形成钠盐。PhOHPhO-Na+，增加电子云密度和流动性 使UV谱 红

16、移。 2. NaOAc： 未熔融: 碱性较弱，只能使黄酮母核上酸性较强 的酚OH解离而使UV谱 红移。 熔 融：碱性，表现出与NaOMe类似的效果。,UV,38,诊断试剂在结构测定中的应用,3. NaOAc / H3BO3：用于鉴定邻二酚OH。 在醋酸钠碱性下，邻二酚OH与硼酸络合，引起峰带红移。,UV,39,诊断试剂在结构测定中的应用,4. AlCl3 5. AlCl3 /HCl： 分子中有3-OH，5-OH，邻二酚OH时，可与Al3+络合，引起吸收峰红移。 铝络合物稳定性： 黄酮醇3-OH 黄酮5-OH 二氢黄酮5-OH 邻二酚OH 二氢黄酮醇3-OH,UV,40,诊断试剂对黄酮类化合物U

17、V谱图的影响及结构的关系,41,诊断试剂对黄酮类化合物UV谱图的影响及结构的关系,42,测定顺序：,1样品/CH3OH,确定黄酮类型,2加诊断试剂：,CH3OH+ NaOCH3,确定4-OH，3 - OH,CH3OH+ NaOAC,确定7- OH,t,对碱敏感的结构,CH3OH+ NaOAC +H3BO3,邻二酚OH,AlCl3/HCl与CH3OH, C3-OH、C5 - OH,AlCl3-AlCl3/HCl,邻二酚OH,3苷类水解后测定苷元的UV光谱，与苷比较。,诊断试剂在结构测定中的应用,UV,43,氢谱在黄酮类结构分析中的应用,常用溶剂: CDCl3、DMSO-d6、C5H5N; 当用D

18、MSO-d6 时: 5-OH: 12.40; 7-OH: 10.93; 3-OH: 9.70。 加入D2O交换后，OH信号消失。,1H-NMR,44,氢核磁共振基础知识（一）,45,氢核磁共振基础知识（二）,1,0,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,C3CH C2CH2 C-CH3 环烷烃,0.2-1.5,CH2Ar CH2NR2 CH2S CCH CH2C=O CH2=CH-CH3,1.7-3,CH2F CH2Cl CH2Br CH2I CH2O CH2NO2,2-4.7,0.5(1)-5.5,6-8.5,10.5-12,CDCl3 (7.27),4.6-5.9,9-1

19、0,OH NH2 NH,CR2=CH-R,RCOOH,RCHO,特征质子化学位移,46,Chemical shift (d),Cl2CHCH3,4 lines; quartet,2 lines; doublet,CH3,CH,氢核磁共振基础知识（三）,47,Chemical shift (d),BrCH2CH3,4 lines; quartet,3 lines; triplet,CH3,CH2,核磁共振基础知识（四）,48,Chemical shift (d),BrCH(CH3)2,7 lines; septet,2 lines; doublet,CH3,CH,核磁共振基础知识（五）,49,C

20、hemical shift (d),OCH3,核磁共振基础知识（六）,50,doublet of doublets,doublet,doublet,核磁共振基础知识（七）,51,Chemical shift (d),ClCH2,CH3,ClCH2CH2CH2CH2CH3,1H,核磁共振基础知识（八）,52,Chemical shift (d, ppm),ClCH2CH2CH2CH2CH3,13C,CDCl3,核磁共振基础知识（九）,53,Chemical shift (d, ppm),核磁共振基础知识（十）,54,Chemical shift (d),C,C,CH,CH,CH,CH2,CH2,

21、CH2,CH3,核磁共振基础知识（十一）,55,1H-NMR在黄酮结构分析中的应用,A 环质子 B环质子 C环质子 糖上质子 取代基团质子,芳环质子 芳环质子 与类型有关 端基质子 -OH、-CH3、 其他质子 -OCH3、,-OCOCH3,黄酮类化合物各质子的信号特征（、峰形状、J、峰面积）,符合芳环质子规律,56,黄酮类化合物A、B环的取代模式,A环取代模式,B环取代模式,57,黄酮类化合物1H-NMR谱,5,7-二取代黄酮,A环,58,5,7-二取代黄酮实例,芹菜素,59,5-H 7.9-8.2 (d, J = 9.0 Hz) 6-H 6.7-7.1 (dd, J=9.0, 2.5 Hz

22、) 8-H 6.7-7.0 (d, J = 2.5 Hz),7-取代黄酮,A环,黄酮类化合物1H-NMR谱,60,7-取代黄酮实例,刺槐亭,61,B环质子形成H-2,6及H-3,5两组 形成AABB系统 总体比A环质子低场 H-2,6比H-3,5低场,4-取代黄酮,B环,黄酮类化合物1H-NMR谱,62,4-取代黄酮实例,芹菜素,63,Chemical shift (d, ppm),OCH3,AABB 取代模式,64,对于黄酮与黄酮醇 H-5作为一个二重峰 (d, J=8.5 Hz)出现在6.7-7.1处 H-2(d, J=2.5 Hz)及 H-6(dd, J=8.5, 2.5Hz) 信号出现

23、在7.2-7.9,异黄酮、二氢黄酮及二氢异黄酮 H-2,5,6作为一个多重峰出现在 6.7-7.1,3,4-取代黄酮,B环,黄酮类化合物1H-NMR谱,65,3,4-取代黄酮实例,木犀草素,66,若3 位和5 位取代基相同时，H-2 , H-6 作为一个单峰，出现在 6.50 7.50。 若3 位和5 位取代基不相同时， H-2 , H-6 将以不同的化学位移分别作为二重峰出现，J=2.0Hz。,3,4,5-取代黄酮,B环,黄酮类化合物1H-NMR谱,67,刺槐亭,3,4,5-取代黄酮实例,68,C环,黄酮及异黄酮,黄酮类C环1H-NMR谱,69,黄酮类C环1H NMR实例,芹菜素 黄酮,70

24、,黄酮类C环1H NMR实例,奥洛波尔 异黄酮,71,黄酮类C环1H NMR,二氢黄酮,72,黄酮类C环1H NMR实例,甘草素 二氢黄酮,73,黄酮类C环1H NMR实例,二氢黄酮醇,74,黄酮类C环1H NMR实例,二氢槲皮素 二氢黄酮醇,75,黄酮类C环1H NMR,H- 6.5-6.7 (1H, d, J=17.0Hz) H- 7.3-7.7 (1H, d, J=17.0Hz),苄氢 6.5-6.7 (1H, s, CDCl3) 6.4-6.9 (1H, s, DMSO-d6),查耳酮及橙酮,76,黄酮类化合物1H-NMR谱,糖,77,黄酮类1H NMR实例,芹菜素-7-O葡萄糖苷,7

25、8,黄酮类化合物1H NMR,5OH： 12 ppm 7OH： 11 ppm 3OH： 10 ppm,其他取代基,79,黄酮类型1H NMR实例,5-OH,7-OH,4-OH,3-OH,木犀草素,80,13C-NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用,苷化位移,骨架类型,81,黄酮类化合物骨架类型,82,黄酮类化合物取代图式,83,黄酮类化合物中糖的连接位置,苷化位移,84,质谱在黄酮类化合物鉴定中的应用,方法：EI-MS（电子轰击质谱）、FD-MS（场解吸质谱）、FAB-MS（快原子轰击质谱） 苷元：EI-MS可得到分子离子峰(强, 往往为基峰)；苷：用FD-MS、FAB-MS或将甙作成甲基化或三甲基硅醚化衍生物，再测EI-MS。,85,主要碎片离子峰为裂解途径I 产生的A1和B1 母核确定 及裂解途径II产生的 B2+ A、B-环取代情况,裂解途径