临床细菌培养鉴定流程及报告

1、,临床细菌培养鉴定常规报告流程,思考题,1、血培养阳性结果如何分级报告？ 2、如何根据尿液菌落计数分析尿培养结果是感染还是污染？,医学微生物实验室基本条件及设备 医学微生物学检验的基本技术 临床各种标本的采集、分离培养及报告方式 临床常见细菌的分离鉴定,一、医学微生物实验室基本条件及设备,细菌实验室 无菌实验室 基本设备,细菌实验室,细菌实验室是细菌检验的场所，在此完成标本接种、孵育、分离、细菌鉴定和药物敏感试验。所以细菌实验室必须具备空气及桌面消毒的条件，确保室内相对无菌。如：足够强度的紫外线灯管，耐酸碱的桌面等。,无菌实验室,无菌实验室仅限于制备、分装无菌培养基的操作，不进行有菌标本的分离

2、及其它操作。无菌室应达到绝对无菌的标准，使用的前后均应严格消毒灭菌（一般均为紫外线照射），仅限操作人员进入，操作时应严格关门。,基本设备,生物安全柜 孵育温箱（有条件的要有二氧化碳培养箱） 显微镜 接种器具 冰箱、冰柜 高压灭菌设备 火焰灯,二、医学微生物学检验的基本技术,基本染色 基本接种方法,基本染色,主要用于形态学检查，因为形态学检查是鉴定细菌的重要手段，有助于细菌的初步鉴别，也是决定采用何种生化鉴定的重要提示。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖器官分泌物中的淋病柰瑟菌等，染色方法主要有革兰氏染色法，抗酸染色法，鞭毛染色法，异染颗粒染色法，墨汁荚膜染色法等。,基

3、本接种方法,曲线划线法（又称连续划线法）、分区划线法、棋盘格划线法、倾注平板法、斜面接种法、穿刺培养法、液体培养基接种法等。,三、临床各种标本的采集、分离培养及报告方式,血（适用胸腹水） 痰 尿 便 脓,（一） 血 当微生物侵入血液迅速繁殖超出免疫系统清除这些微生物的能力时形成菌血症或真菌血症。1.血培养中常见的分离菌,革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌 凝固酶阴性葡萄球菌 肺炎链球菌 a群b群链球菌 肠球菌,革兰氏阴性菌 大肠杆菌 肺炎克雷伯菌 阴沟肠杆菌 产气肠杆菌 伤寒沙门菌 绿脓杆菌 鲍曼不动杆菌,2. 标本的采集与运送 采血指征 一般患者出现以下体症时可作为采血的重要指征：发热（38）或低

4、温（36 ）、寒战、白细胞增多（计数10000109/l），特别有“核左移”未成熟的或杆状核白细胞，皮肤黏膜出血，昏迷，多器官衰竭，血压降低，crp升高及呼吸快，特殊患者（如血液病）出现粒细胞减少，（成熟的多形核细胞1000109/l ）血小板减少等，或同时具备上述几种体征时而临床可疑菌血症应采集血培养。新生儿菌血症应该增加尿液和脑脊液培养。最好在感染患者未进行系统性抗菌药物治疗之前及时采集血培养。,采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使用抗菌药之前进行，在24小时内采集23份血培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到来之前0.51小时，采

5、集血液，或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量810ml，儿童15ml。血液和肉汤之比1：5 1：10。,标本运送 采血后应立即送检，如不能立即送检，需室温保存或置3537孵箱中，切勿冷藏。自动化连续检测系统虽有允许延迟上机检测微生物生长的原理，还是应该尽量减少延迟上机时间。,3.分离培养,血培养操作过程中应注意生物安全防护。 血培养瓶处理 传统手工法血培养每天至少检查一次，注意微生物生长可视信号，应无菌抽取培养物，涂片革兰氏染色，选择合适的培养基转种，同时做药敏试验。 培养基的选择 一般革兰氏阳性菌选血琼脂，革兰氏阴性球菌选血琼脂、巧克力琼脂，革兰氏阴性杆菌再加一个中国兰或麦康凯培养基，真菌

6、需转种于真菌培养基。根据生长情况，挑取纯菌落进行进一步鉴定。,4.结果报告 阳性结果报告 初级报告：阳性血培养结果非常重要，应该立即口头报告给医生，包括革兰氏染色特性和形态，疑似何种菌等。同时记录报告日期、时间、内容以及接受报告人的姓名。 中级报告：报告直接抗菌药物敏感试验结果和细菌种属的初步鉴定结果。 最终报告：报告细菌种属名和标准抗菌药物敏感试验结果。 阴性结果报告 普通血培养3天无菌生长可报告为“72小时培养未见细菌生长”但培养瓶要继续培养至7天，如果发现有菌生长，可发补充报告，某些特殊致病菌培养时间需延长。,（二）痰（即下呼吸道感染标本） 临床通常将正常人喉以上部位称为上呼吸道，上呼吸

7、道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管支气管炎、慢性支气管炎急性发作，支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次氏体和原虫等。 下呼吸道感染者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，是下呼吸道感染细菌检查的主要标本。细菌学检验能明确感染病原，并提供有关抗菌药物对分离菌的抗菌活性，有助于疾病的治疗、流行病学调查研究和医院感染的监测。,1.呼吸道标本(痰)中常见的分离细菌,革兰氏阳性菌 草绿色链球菌，肺炎链球菌，化脓性链球菌 表皮葡萄球菌 ,金黄色葡萄球菌,其他葡萄球菌 微球

8、菌，消化链球菌，消化球菌 肠球菌 真杆菌，丙酸杆菌，乳酸杆菌 放线菌，奴卡苗，结核分枝杆菌 白喉棒状杆菌，类白喉棒状杆菌 念珠菌,革兰氏阴性菌 韦荣球菌 脑膜炎奈瑟菌，其他奈瑟菌 卡他莫拉菌 肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌 沙雷菌，变形杆菌 大肠埃希氏菌及其他肠杆菌科细菌 百日咳鲍特菌，不动杆菌 铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属细菌 嗜肺军团菌，气单胞菌 流感嗜血杆菌，付流感嗜血杆菌 拟杆菌，梭杆菌,2.标本采集及运送 对可疑烈性呼吸道传染病(如sars，肺炭疽，肺鼠疫等)的患者采集痰标本时必须注意生物安全防护。 自然咳痰法（最常用的方法）：以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或牙刷清洁口腔和牙

9、齿。尽可能在使用抗菌药物之前采集标本，用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量要1ml。标本要尽快送检，不能及时送检的标本室温保存2小时。,支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按照相应操作规程采集，但必须注意所采集标本尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。 小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。,分离培养 (1) 痰标本培养前处理：不含或粘液很少的标本可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂（如

10、ph7.6的10g/l胰酶溶液等），放置35待充分液化再行接种 。亦可加液化剂后搅拌混匀离心，取沉淀物接种。 一般细菌分离培养：将处理后的痰标本分别划区接种于血平板(适用于分离肺炎链球菌和其他细菌),巧克力平板(适用于分离嗜血杆菌)和麦康凯/中国兰平板。巧克力平板需置5%二氧化碳环境（无二氧化碳培养箱可用烛缸），35 培养24小时后观察菌落形态，涂片染色，挑取可疑纯菌落，做进一步鉴定。,结果分析及报告 结果分析 痰及下呼吸道分泌物标本易受到定植在上呼吸道的正常菌群污染。当从送检标本中分离出多种细菌时，确定那一种分离细菌是引起下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断与治疗至关重要。当在同一培养基上分离

11、出1种以上的病原菌（复合菌）时，要结合患者的临床症状，涂片染色镜检情况及患者近期细菌分离培养结果等，综合判断所分离的多种细菌中那一种细菌可能为致病菌，通常多为优势菌。当分离的优势菌与涂片染色镜检结果一致时，要做药敏试验。若分离培养结果与涂片染色镜检结果不一致时，可不进行药敏试验，以免误导，仅报告分离鉴定结果，由临床大夫定夺是否重试。,报告方式 由于检验结果报告的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步和最终结果报告。 初步报告：当标本涂片革兰氏染色细胞学和细菌学镜检发现有临床诊断意义的结果时，应及时发出描述性的初步报告。 最终报告：镜检结果与分离培养结果相一致时，最终报告规范的细菌名称和药敏

12、试验结果。若分离培养结果与镜检结果不一致时，仅报告分离鉴定结果，不做药敏试验。若分离培养未检出优势菌，可报“未培养出病原菌”。,(三) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液中分离出细菌（排除污染因素）即为菌尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性还可出现前列腺炎。,1.尿中常见分离菌,革兰氏阳性菌 金黄色葡萄球菌 血浆凝固酶阴性葡萄球菌 肠球菌 a群链球菌 结核分支杆菌 念珠菌,革兰阴性菌 大肠埃希菌 克雷伯菌属 变形杆菌属 淋病奈瑟氏菌 肠杆菌属 假单胞菌属

13、罗威登菌属 沙雷菌属 不动杆菌属 假单胞菌属, 标本的采集与运送 尿培养检查的临床指征(有下列情况之一者，应进行尿培养） a.有典型的尿路感染症状 b.有肉眼脓尿或血尿 c.尿常规白细胞和/或亚硝酸盐阳性 d.不明原因的发热而无其他局部症状 e.留置导尿管的病人出现发热 f.膀胱排空功能受损 g.泌尿系统疾病手术前,(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留置导尿,(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应置48冰箱保存，冷藏保存标本时间不得超过8

14、小时。,3分离培养 一般培养: 用定量接种环或无菌微量加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数，3537培养1824小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需条件接种相应特殊培养基，放置相应条件下进行培养。,4结果分析及报告 结果分析: 一般单种细菌菌落数105cfu/ml可能为感染，需要进一步鉴定和做药敏试验；104cfu/ml可能为污染；在两者之间需要根据病人的临床表现进行评估。对于导尿标本103cfu/ml即为感染；耻骨上膀胱穿刺标本任意数目即为感染，均需进一步鉴定和做

15、药敏试验。,(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计数1000cfu/ml或 100cfu/ml尿。,（四）粪便 急性感染性腹泻可以由细菌、病毒及原虫引起，实验室常规检查是细菌培养。每种感染性腹泻的致病菌因其独特的致病机理而引起一系列不同的典型症状，这些症状和详细的病史能为诊断腹泻疾病类型提供依据。因此，为了查找腹泻病因，必须了解患者的病史即：症状、发病时间、年龄、旅游史

16、、进食情况和使用抗菌素情况。,致病菌能够破坏宿主的防御系统，其致病机理是细菌产生毒素和对人体组织的侵袭性，值得注意的是有些细菌既具有侵袭性又能产生毒素。抗生素治疗可以破坏宿主的正常菌群，导致某些细菌如艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和念珠菌等过度生长，也可引起腹泻。沙门氏菌、志贺氏菌、气单胞菌和邻单胞菌应作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。,粪便标本中常见的病原菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其他沙门菌 厌氧链球菌种 志贺菌属 结核分枝杆菌 致病大畅埃希菌 产气荚膜梭菌 弧菌属菌种 艰难梭菌 气单胞菌和邻单胞菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌,2标本的采集与运送 粪便培

17、养检查的送检指征(出现以下任何一种情况时建议做粪便培养) a.粪便涂片镜检白细胞5/hp b.重症腹泻 c.体温38.5 d.血便 e.便中有脓液 f.未经抗菌药物治疗的持续性腹泻患者 g.来自疫区的患者,(2)标本采集 a.标本采集尽可能在发病早期和使用抗菌药物治疗之前 b.自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便，液体粪便则取絮状物 c.直肠拭子采集粪便标本，适用于排便困难患者和婴幼儿,标本运送 a.粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过2小时。如不能及时送检，可加入ph7.0的磷酸甘油或转运培养基，但不易超过24小时 b.直肠拭子采集的标本必须置于适当的运送培养基内，转

18、运时间不宜超过2小时 c.高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求,3. 分离培养与镜检 粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感染。如果肠道菌群紊乱，革兰氏染色镜检结果可以提示是酵母菌还是葡萄球菌感染。,腹泻病原菌常规培养 腹泻病原菌种类繁多,实验室不可能对所有可能引起腹泻的病原菌都进行培养。为保证获得较高的检出率,可以对患者进行腹泻病原菌常规培养,包括沙门氏菌、志贺氏菌、气单胞菌、邻单胞菌、弧菌，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。粪便标本至少接种ss、中国兰等培养基，必要时加血平板，培养1824小时观察结果。,(2)腹泻病原菌特殊培养

19、 根据所疑病原菌的生长要求,选择合适的选择培养基进行分离培养鉴定。,4结果分析及报告 阳性结果：报告细菌种名和药敏结果 阴性结果：常规细菌培养阴性应报告“未检出常规培养病原菌” 特殊细菌培养阴性应报告“相应细菌阴 性筛选结果”,（五） 脓汁（病灶分泌物） 微生物存在于周围环镜中，也存在于皮肤、粘膜表面，它们通过破损的皮肤或粘膜进入通常无菌的组织引起感染，在一个或多个解剖部位形成小脓庖或包裹性脓肿。细菌和真菌（条件致病菌或致病菌）都可导致炎性渗出，渗出物由白细胞、入侵病原体、体液及纤维蛋白混合组成，即：脓汁。病毒感染很少出现脓性分泌物。,1脓汁（含创伤分泌物）中常见的病原菌 革兰氏阳性菌 革兰氏

20、阴性菌 葡萄球菌 肠杆菌科细菌 链球菌 假单胞菌 消化链球菌 腐败谢瓦纳拉菌 炭疽芽胞杆菌 拟杆菌 破伤风芽胞梭菌 梭杆菌 产气荚膜梭菌 嗜血杆菌 溃疡棒状杆菌 产碱杆菌 结核分枝杆菌 无色杆菌 放线菌、奴卡菌 弧菌属细菌 念珠菌 气单胞菌,2标本采集与运送 标本采集与运送 脓肿包括闭合和开放性，即感染伤口、穿透伤口、术后伤口、烧伤及褥疮等。在采集脓汁标本前，用无菌生理盐水擦去表面分泌物以避免污染。开放性伤口尽量抽吸深部脓液，闭合性脓肿抽吸脓肿壁。若需要厌氧培养，最好进行床前接种迅速放入厌氧袋为好。 (2)标本运送 脓汁或厌氧袋，室温下2小时内，最长不超过24小时送达实验室。,3分离培养与镜检

21、 脓汁标本在培养的同时应涂片做革兰氏染色镜检，特殊情况或医生要求，需行直接镜检及抗酸染色镜检。革兰氏染色镜检有助于确定培养检查范围，评价标本质量。若见大量上皮细胞，则很可能为表皮污染，此时生长的菌落意义较小；大量多形核白细胞或吞噬细胞则提示有感染存在。,根据镜检检查结果和/或感染部位，选择接种合适的培养基。所有脓汁或渗出液标本应至少接种三种培养基。 营养血琼脂培养基：分离葡萄球菌及链球菌等。有条件最好置含510%二氧化碳环境中，3537孵育至少48小时。 (2)选择培养基（麦康凯或伊红美蓝琼脂等）：分离革兰氏阴性杆菌。3537孵育至少48小时。 营养肉汤管：如巯基乙酸盐肉汤或庖肉培养基，供需氧菌及厌氧菌生长，3537孵育，至少培养10天。,4结果分析及报告 阴性结果：培养48小时后，平皿和肉汤均无菌生长，报告“48小时无菌生长”。特殊原因，培养基放置更长时间仍无菌生长，报告为“x天无菌生长”。 阳性结果：根据鉴定及药敏试验结果报告。,四、 临床常见细菌的分离鉴定 1形态与培养特性 革兰氏染色：在生长有细菌的平皿上挑取可疑病原菌纯菌落涂片,革兰氏染色,在显微镜下观察细菌形态特征：球状、杆状、弧状等，识别是革兰氏阳性还是革兰氏阴性菌，确定下一步的鉴定路线。 (2)氧化酶试验：对革兰氏阴性杆菌，首先要做氧化酶