一微生物细胞的化学组成.ppt

1、武汉职业技术学院,微生物技术应用,背景知识四：微生物生长测定技术,知识节点一 微生物的营养 知识节点二 微生物培养基及制备技术 知识节点三 微生物的生长规律 知识节点四 微生物生长繁殖的测定技术 知识节点五 环境对微生物生长的影响,知识节点一 微生物的营养,一、微生物是由哪些化学元素组成的？ 二、微生物需要哪些营养物质？各有什么作用？生产和实验中常由哪些物质充当？ 三、微生物有哪些营养类型？各类型的典型微生物有哪些？ 四、微生物营养物质如何运输到细胞内的？,一 微生物细胞的化学组成,微生物细胞,水：70%-90%,干物质,有机物 蛋白质、糖、脂、核酸、维生素等 及其降解产物,无机物（盐）,微生

2、物、动物、植物之间存在“营养上的统一性”,细胞化学元素组成：,主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、镁、钙、铁等； 微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。,二、微生物的营养物质及其作用,微生物与动植物营养要素的比较,微生物生长所需要六大营养要素：,碳源、氮源、无机盐、生长因子、水、能源,1 碳源（Carbon source）,定义：凡可被用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质。,功能：提供合成细胞物质及代谢物的原料;并为整个生理活动提供所需要能源（异养微生物）。 种类: 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、 麸皮、米糠等

3、；饴糖；单糖）,脂类、 醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物 以及各种含氮的化合物。,微生物工业发酵中用做碳源的原料,传统种类：糖类（单糖，饴糖） 淀粉（玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 麸皮 各种米糠等 代粮发酵：纤维素、石油、CO2、H2,凡用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养源。 种类：无机氮：铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、 尿素、 氨、N2等； 有机氮：蛋白质及其降解产物（如胨、肽、 氨基酸等）、牛肉膏、鱼粉、花生饼粉、 黄豆饼粉、玉米浆等 功能： 1）提供合成细胞中含氮物，如蛋白质、核酸，以及含氮代谢物等的原料； 2）少数细菌可以铵盐、硝酸盐等氮源为能源。,2氮源（Nitrogen so

4、urce ）：,3无机盐（inorganic salt）,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式共给。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）,一般微生物生长所需要的无机盐有：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钠、钾、镁、铁等金属元素的化合物。,无机盐的生理功能,4 生长因子（growth factor）：,定义:是一类对微生物正常生活所不可缺少而需要量又不大，但微生物自身不能用简单的碳

5、源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。,缺乏合成生长因子能力的微生物称为“营养缺陷型”微生物。,嘌呤和嘧啶：用于合成核酸 (DNA and RNA) 氨基酸：蛋白质合成 维生素：构成酶的辅基或辅酶,根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：,野生型(wild type) 原养型 不需要生长因子而能在基础培养基 上生长的菌株 营养缺陷型(auxotroph) 由于自发或诱发突变等原因从野生 型菌株产生的需要提供特定生长素物 质才能生长的菌株,5 水,水是微生物最基本的组成分（7090） 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代

6、谢废物） 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）,异养型生物,自养型生物,生长所需要的营养物质,生物生长过程中能量的来源,光能营养型,化能营养型,三、微生物的营养类型,光能自养型：以光为能源，不依赖任何有机物即可正常生长 光能异养型：以光为能源，但生长需要一定的有机营养 化能自养型：以无机物的氧化获得能量，生长不依赖有机营养物 化能异养型：以有机物的氧化获得能量，生长依赖于有机营养物质,四、微生物营养物质的运输,营养物质通过质膜的方式有4种： 单纯扩散 促进扩散 主动运输 基团转移,知识节点二 微生物培养基及制备技术,一、什么是培养基？ 二、培

7、养基有哪些类型？各自有什么用途？ 三、配制培养基应遵循什么原则？如何操作？,一 微生物培养基,定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。,用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础,任何培养基都应该具备微生物生长所需要六大营养要素：,碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水,任何培养基一旦配成，必须立即进行灭菌处理；,常规高压蒸

8、汽灭菌： 1.05kg/cm2,121.315-30分钟；0.56kg/cm2,112.615-30分钟某些成分进行分别灭菌； 过滤除菌；,二、培养基的类型及应用,（一）按微生物的种类分类 细菌培养基，放线菌培养基，霉菌培养基，酵母培养基 （二）按培养基的成份分类 可分为合成、天然、半合成培养基。 （三）按培养基用途分类 可分为基础培养基、富集培养基、选择培养基、鉴别培养基等 。 （四）按培养基的物理状态分类 可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基,（一）配制培养基的原则 虽然培养基的配方和种类很多，但是培养基的制备遵循以下的原则 。 1.适合目标微生物的营养特点 2.按微生物需要量调好营

9、养物浓度和配比 3.控制微生物的培养条件 4.经济节约原则,三、培养基的制备技术,（二）培养基的制备方法 根据培养的微生物种类和目的选择适当的培养基配方和类型，按照下面基本步骤制备培养基。,注意： 配制培养基时应注意防止产生沉淀、光热分解和杂菌感染等造成营养成份的损失。 易受高温破坏的试剂单独配制，过滤灭菌后，在使用前加入。,知识节点三微生物的生长规律,一、单细胞微生物的生长有什么规律？（生长曲线） 二、微生物生长规律对工业生产有什么指导意义？,一、单细胞微生物的生长曲线,微生物繁殖方式多种多样，生长繁殖和死亡的规律也不完全相同。,单细胞微生物（如细菌、酵母菌）的典型生长曲线包 延滞期、指数期

10、、稳定期和衰亡期 真菌的生长曲线大致可分3个时期 生长延滞期、快速生长期和生长衰退期。,（一）延滞期/停滞期/调整期/适应期 特点：细胞数目恒定或增加很少，生长速率R0。 原因：接种到新鲜培养液中的细菌的代谢系统需要一些时间来进行调整，包括重新调整酶和细胞结构成份以适应新环境，一般不立即开始繁殖。,细菌延滞期的长短： 取决于菌种的遗传特性、菌龄、菌种的接种量及接种前后培养条件的差异等，从几分钟到几小时不等。 以指数期的菌作种子，子代培养物的延滞期短。,（二）指数期 特点：生长速率常数R最大，代时（世代时间或增代时间）或原生质增加一倍所需的倍增时间最短 原因：延迟期末，细菌已适应了新环境，平衡生

11、长，菌体各部分的成份按比例有规律地增长，各种酶活性高而稳定，代谢活力强，分裂速度快，菌数以几何级数增加，其生长曲线表现为1条上升的直线，如右图。,世代时间的计算： N t= 2 n No ， n为繁殖代数 (lgNtlgNO) n= =3.322(lgNtlgNO) lg2 3.322（lgNtlgNO） 其生长速率常数 R = ( t2 t1) 1 ( t2 t1) G= = R 3.322（lgNt lgNO）,（三）稳定期 特点：细菌的繁殖速率和死亡率趋于平衡即生长速率常数R0 原因：在指数末期，由于营养物质尤其是生长限制因子的耗尽、营养物营养物的比例失调如CN比不合适等、酸、醇、毒素或

12、H2O2有害代谢产物的积累及培养环境中pH和Eh等物理化学条件的变化，使细菌的繁殖速率下降而死亡率逐渐上升。,（四）衰亡期/对数死亡期 特点：微生物群体呈现负生长状态(R0)，活菌数的对数与时间成反比，按几何级数下降 原因：由于营养和环境条件的进一步恶化，细胞内的分解代谢明显超过合成代谢，使死亡率迅速增加，这时尽管群体的总菌数仍然可能较高，但活菌数急剧下降，微生物的个体死亡速度超过新生速度。,二、微生物生长规律 对工业生产的指导意义,1缩短延滞期 缺点：延滞期将延长生产周期而降低设备的利用率 2把握对数期 在发酵工业中通过连续流加或补加发酵原料，使菌体随着营养浓度增加而提高生长速率， 提高得率

13、。,3延长稳定期 通过补料，调节pH、温度或通气量等措施来延长稳定期。向发酵体系中连续流加营养物、移走代谢产物的培养方式即为连续培养。 特点：对微生物的生存是必需的；各种微生物产生种类相似的初级代谢产物；这些产物的形成与微生物细胞的形成过程同步，见图4-6（a）和图4-7（a） 最佳收获时机:稳定期,次级代谢 次级代谢产物：与微生物的生存、生长和繁殖无关的代谢产物（抗生素、生长激素、生物碱、维生素、色素和毒素等） 特点：形成过程与微生物细胞生长过程不同步，见图4-6（b）、图4-7（b）和图4-7（c）。 形成的高峰往往在微生物生长的稳定期后期或衰亡期。通过连续培养等方式，可以延长稳定期，提高

14、次级代谢物的产量。,4监控衰亡期 进入衰亡期，积累的微生物代谢毒物可能与代谢产物发生反应或影响提纯，必须在合适时候结束发酵,知识节点四 微生物生长繁殖的测定技术,微生物生长测定的方法分为计繁殖数和测生物量两类，每一类中又有直接测量的方法和间接测量的方法。 一、每种方法什么情况下适用？有什么有缺点？ 二、每种方法怎样进行？ 三、如何绘制生长曲线？,一、计繁殖数（一）直接法 1. 显微计数法 2. 粒子计数器法 3菌丝长度测定法 （二）间接法 1比色法 2稀释平板计数法 3液体稀释培养计数法 4浓缩法 二、测生物量（一）直接法 1. 细胞干重法 2. 细胞堆积体积测定法 （二）间接法 1总氮量测定

15、法 2DNA含量测定法 3ATP测定法 4代谢活性法,一、计繁殖数（一）直接法,1. 显微计数法 采用血球计数板法进行计数，即将一定稀释度的细胞悬液加到固定体积的计数器小室内，在显微镜下观测并记录小室内细胞的个数，计算出样品中细胞的浓度。,一、计繁殖数（一）直接法,2. 粒子计数器法,2、粒子计数器法 适用范围：单细胞微生物 优点是可以同时测出细胞数目和大小 缺点是无法区分细胞与其他固体颗粒，因此样品中不能有细胞以外的其他颗粒存在。,3菌丝长度测定法 针对丝状真菌生长的测定，是活菌的测量方法。,1比色法（比浊法） 根据在一定的浓度范围内，菌悬液中的微生物细胞浓度与液体的光密度成正比，与透光度呈

16、反比的原理，可使用分光光度计测定各种微生物悬液中细胞的数量。一般选用450650 nm波长。,2稀释平板计数法 通常是先将待测样品作一系列稀释，每个稀释度在三个以上的平皿中培养生成菌落，即菌落形成单位（CFU），取其平均值，根据合适稀释度的平皿菌落数进行含菌量计算。,一、计繁殖数（二）间接法,菌落数x稀释倍数=菌体个数/每毫升原样,两种常用的平板计数法操作方法,一、计繁殖数（二）间接法,液体稀释培养计数法 本法特别适合于测定土壤微生物中特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、自生固氮、根瘤菌、硫化和反硫化细菌等）的数量和检测污水、牛奶及其它食品中特殊微生物类群的数量。,液体稀释培养计数法操作示意

17、图,4浓缩法 适用范围：本法适用于检测微生物数量很少的水和空气等样品。 方法：测定时让定量的水或空气通过特殊的微生物收集装置（如微孔滤膜等），富集其中的微生物，然后处理滤膜使之透明，显微计数，或者将收集的微生物洗脱后按上面各法测数，再换算成原来水或空气中的数量。,二、测生物量,二、测生物量 （一）直接法 1. 细胞干重法 2. 细胞堆积体积测定法 （二）间接法 1总氮量测定法 2DNA含量测定法 3ATP测定法 4代谢活性法,五 环境对微生物生长的影响,生长是微生物与外界环境因子共同作用的结果。 微生物与环境之间相互作用 影响微生物生长的外界因素很多 主要有 物理 化学 生物因子 最主要的是营养物质、水、温度、pH和O2 培养基时控制微生物的培养条件是一条基本原则。,有哪些因素影响微生物的生长？怎样影响？ 一、营养物质 二、水的活性和渗透压 （一）水的活度 （二）渗透压 三、温度 （一） 温度对微生物的作用 （二）微生物的温度类型 四、pH值 五、氧和Eh值,一、营养物质,限制性营养物浓度对微生物生长速度和菌体产量的影响,二、水的活性和渗透压,缺水的干燥环境不适于微生物生活，长期失水将导致死亡。渗透压主要影响溶液中水的可给性，若环境溶液中的溶质过高，渗透压过大，也将抑制微生物的生长繁殖（高糖高盐环境抑制微生物生长）。,三、温度 微生物的生命活动都是由一系列在