手足口病实验室检测方案 中国疾病预防控制中心

1、附件3手足顾颉刚病实验室检测方案(试点)为了规范手足口病的标本采集、运输及实验室检查操作程序，提高检查精度，为手足口病的明确诊断及相关实验研究提供可靠依据，特别制定本方案。手足口病实验室检测原则和程序手足口病的诊断一般是在采集了适当的林爽标本后通过病毒分离和病毒鉴定进行的，如果没有采集适当的林爽标本或不能进行病毒分离，可以通过血清学检查(如中和实验)检测血清中中和抗体，或者直接从林爽标本中检测病毒的核酸进行诊断(见下图：手足口病的实验室诊断流程图)。通常省级病毒研究所分离病毒，如果爆发范围大，国家参考实验室也可以提供技术支持。(莎士比亚，北方病毒(美国电视剧)病毒分离成功后，将被送到国家三比实

2、验室进行鉴定或审查，对全国手足口病的病原体进行病毒学监测。国家参考实验室在收到标本后30天内将结果反馈给省级实验室。许多血清素肠道病毒会引起手足口病，不同的细胞系对病毒的敏感性不同，不同时期肠道病毒的流行株也不同。肠病毒分离常用的细胞株包括RD细胞(对CA16和EV71敏感)、HEp-2细胞(对某些科萨奇B组病毒敏感)等，如果结合使用这两个或更多细胞(例如Vero细胞)，就有助于分离更多肠道病毒。利用血清型特异性中和抗血清进行中和实验是肠道病毒识别的基本方法，使用适当的抗血清，实验结果比较可靠。肠道病毒包含多个血清型，一般使用组合抗血清进行鉴定，部分组合抗血清已经商品化。当不能进行病毒分离或无

3、法获得适合病毒分离的标本时，血清学检查可以提供肠道病毒感染的间接证据。一般来说，急性血清和恢复期血清的检查结果比较，结果显示抗体举重提高了4倍以上，有急性感染。但是无症状肠道病毒感染也很常见，所以对检查结果的说明要慎重。为了提高检验速度，为了辅助中和试验法，还进行了独奏鉴定，最近很多实验室都在使用分子生物学方法。目前用分子生物学方法定型肠道病毒还没有统一的标准，必须根据检查目的选择适用的方法。评估测试结果从林爽标本中分离出肠道病毒，尤其是脑脊液、疱疹液，很可能是这种病毒引起疾病的原因。血清学诊断方法可以作为病毒感染的间接证据，除非病毒无法分离或被病毒分离。分子生物学方法(如RT-PCR)对难以

4、分离的肠道病毒很有用。肠道病毒有时会引起无症状感染，因此实验结果的实际意义应与林爽过程和流行病学资料一起解释。实验室诊断标准根据手、脚、嘴等部位的典型皮疹，可以进行HFMD林爽诊断，流行病学接触史有助于诊断，林爽诊断案例之一是实验室诊断案例。1、患者粪便样本、吞咽样本中病毒分离阳性率远高于对照组。2、肠道病毒特异性中和抗体效价1:256；恢复期血清中肠道病毒型特异性中和抗体比急性期提高了4倍以上。3、在病变组织中，被疱疹液和脑脊液等病毒分离。4.患者血清，疱疹液，脑脊液等标本中检测出了致病源核酸。一、抽样对象样本收集对象包括发病时手足口病的林爽诊断病例和病例发病的社区(村)附近的无病社区(村)

5、或保育机构5岁以下的儿童(作为健康对照)。用于病毒分离的标本包括粪便、吞咽和疱疹液，如果患者出现神经系统症状，可以提取脑脊液标本。血清学诊断的情况下，急性期和恢复期要收集双血清标本。林爽标本在运输和保管过程中应避免重复融化，如果不能保证-20的条件，则应在0 8运输和保存。标本要冷冻运输，运输时要附上标本编号、发病日期、标本收集日期等必要信息。二、标本类型和收集运输(a)粪便样本采集患者发病7天内的粪便标本，用于医院检查。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采管内，4立即送到(12h内)实验室，-20以下的低温冷冻保存应长期保存在-70冰箱内。(b)咽拭子标本采集患者发病3天内吞咽标本

6、，用于医院检查。用专用样品棉棒适当擦拭后壁和两侧扁桃体部位，避免接触舌头。迅速将棉签放入含有3 5毫升保存液(建议保存液或生理盐水、保存液)的样品管，在顶部附近折断棉签，转动盖子防止干燥。4立即(在12h内)送到实验室，-20以下的低温冷冻保存需要长期保存的标本保存在-70冰箱。(c)血清标本急性气相收集(发病03d)和恢复期(发病1430d)双对双对血清用于抗体检查。静脉取3 5毫升全血，放入真空无菌债血管中，自凝后分离血清，将血清冷冻保存在-20以下的冰箱中。(d)疱疹溶液在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液分离到病毒具有很高的诊断价值，同时可以取样多种疱疹。首先用75%的酒精消毒疱疹周围的

7、皮肤，然后用消毒针选择疱疹，然后用棉签蘸棉花提取疱疹液，迅速将棉签放入含有3 5毫升保存液(建议保留液或生理盐水、保留液)的样品管，在顶部附近折断棉签，拧紧盖子，将其密封。采集的标本4应立即送到(12h内)实验室，-20以下的低温冷冻保存应长期保存在-70冰箱。(e)脑脊液标本如果出现神经系统症状，就要采集脑脊液标本，和医院进行抗体检查，从脑脊液中分离病毒，也有很高的诊断价值。采集时间是神经系统症状出现3天后采集量为1.0 2.0毫升。采集后，在放无菌带垫圈的冷冻保管管内，4立即送到实验室(12h以内)，-20以下的低温保存应长期保存在-70冰箱内。(6)案件紧密联系者的抽样选择具有典型病例的

8、托儿所或村庄，以新病例和密切接触者为样本，采集一个粪便和血清标本。(7)收集健康控制标本选择儿童病发病的社区(村)无病例的社区(村)或幼儿园。采集一份5岁以下儿童的粪便和血清标本。三、标本收集时的注意事项在手足口病的实验室诊断中，将病毒与疱疹液或脑脊液分离具有很高的诊断价值，但脑脊液中的病毒分离率因血清素而异，差异很大。采集吞咽棉签的无菌棉签必须放在适当的保存液(如乳脂或生理盐水)中，以防止干燥。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法相同。为了确保检查结果的准确性和有效性，标本在病例发病后应尽快采集，尽快检查。不能立即检验的标本要冷冻保存。血清学诊断，急性血清应在发病后尽快采集，

9、恢复期血清应在发病2周后采集。四、实验室测试运行过程(a)病毒分离1.配置试剂(1)细胞生长液、维持液的配制见下表增长额(GM)保留额(MM)Eagles液体(MEM)86.5ml92.5mlL-谷氨酰胺200mM1.0ml1.0ml胎牛血清10.0ml2.0ml7.5%NaHCO3溶液2.5ml3.5mlP.s溶液*(青霉素和链霉素)1.0ml1.0ml(2)粪便标本处理液在完全PBS液中加入P. S溶液，最终浓度为青霉素500单位/ml，链霉素为500g/ml。病毒分离细胞株很多细胞系可以支持EV71、CA16等人类肠道病毒的生长。以检测手足口病为例，所有怀疑EV71、CA16的标本最好接

10、种于以下两种细胞系：RD细胞来源于人类横纹肌肉瘤细胞。HEp-2细胞来源于人喉癌上皮细胞。3.标本处理(1)粪便标本处理程序：1.1在离心管上显示样本号。每1.2管加入10ml PBS，1g玻璃珠，1ml氯仿。1.3在生物安全柜中，将每个粪便标本放入标记约2g的离心管(确保离心管的标签与原始标本的标签一致)。1.4剩下的原始标本最好留在原来的容器里-20冷冻保存。拧紧1.5离心管，用机器振动器20min剧烈振动。1.6使用冷冻离心机，使离心机的盖子盖好，并密封离心机，在1500g条件下为20min离心。1.7在生物安全柜中，将每个标本的上清液吸入各有两个外部螺旋盖的冷冻保管管(如果上清液不清，

11、则需用氯仿再处理一次)。1.8一管的粪便在-20冷冻，作为备份，另一管在4 8保存，准备接种。(2)疱疹溶液标本处理疱疹液体标本通常直接用于病毒分离。(3)脑脊液标本处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。(4)咽拭子标本处理咽拭子应充分搅拌在标本运输(保存)液中(至少40次)，清洗附着在棉签子上的病毒和含有病毒的细胞等，然后在4条件下用10000 rpm离心20min，上听接种接种接种细胞。发现细菌污染后，要用过滤器过滤细菌。免疫和观察(病毒分离)(1)用显微镜观察单层细胞，确保细胞健康。健康的单层细胞在后期3d左右形成。(2)丢弃增长额(GM)，改为1 1.2毫升维持额(MM)。(3)每个标本

12、必须同时接种2个RD细胞和2个HEp-2细胞，正确地标记每个细胞培养管(包括标本的编号、日期、代数)。(4)每个细胞至少显示一个管作为语音对照。(5)每个试管接种0.2ml的标本显液，培养温度为36C(AHC标本的病毒分离，特别是EV70的分离培养)，最好降低培养温度。通常34 35C)；(6)用显微镜每天观察细胞培养管，观察特征性肠道病毒引起的细胞病变效应(CPE)的发生，如细胞变圆，折射加强，脱离管壁等。(7)记录接种管和控制管细胞的变化至少一周，记录CPE(1 4)，细胞受毒性反应、老化或污染影响而发生的变化(1，25%)。2，25%到50%；3，50%到75%；4，75%到100%)；

13、(8)出现特征性肠道病毒CPE时，如实记录，观察(3 CPE)，直到75%的细胞发生变化，然后储存在-20 C，准备第二代。对同一病例的二次传代病毒分离物可以放在一起做进一步检查。(9)第一代培养在看到可疑细胞病变时继续传代，细胞病变稳定出现后，-20C或-70C冻结。(10)第一代阳性分离物再传递第二代，如果出现明显的CPE，将病毒保存在-20 C冰箱(第二代病毒)中。第二代病毒的效价比第一代病毒高，所以使用第二代病毒进行鉴定。(11) 7d后CPE未出现，盲第一代继续观察7d。(注：同一病例标本的细胞培养物不能混合。例如，其他细胞的培养物必须单独继承。）(12)如果在猛攻2台后CPE没有出

14、现，则判定为语音。(13)注：如果接种后24小时内出现CPE，很可能是标本非特异性成分引起的毒性反应。将100l阳性分离物导入第二代，继续观察。或者接种标本吸出1h后，用乳脂液清洁细胞层，可以降低毒性反应。(14)一些概念：答：毒性反应：接种后12d内的细胞迅速死亡，标本中含有毒性物质，可能是非特异性毒性反应。这种接种的标本的试管必须在-20冷冻融化后，将0.2毫升接种到同一类型的细胞(现在是第二代)。另外，出现毒性反应时，要用PBS稀释原始标本10倍，重新接种到同种细胞上。这时应该被认为是第一代。b:微生物污染：由于细菌污染导致的培养液混浊或细胞死亡，病毒引起的CPE经常不确定或完全不出现。

15、重新取样，用氯仿处理，按照上述步骤重新接种到新鲜细胞。c:激战：有时一周后，前代细胞老化，甚至细胞对比也出现病变。此时，接种标本的试管在-20冷冻融化后，将0.2毫升接种到相同类型的新鲜单层细胞后，应观察710d。如果盲战第二代后仍然没有产生CPE，我认为这个标本是阴性的。病毒分离结果说明如下：RD细胞支持HFMD的主要病原体CA16和EV71的克隆，CA16和EV71都在RD细胞培养中产生了特殊的肠道病毒CPE(细胞变异效应)，显示细胞原轴、扩散、细胞内颗粒增加，最终细胞从管壁脱落。但同一滴的CA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同。EV71的生长速度比CA16快，表明EV71感染RD细

16、胞后CPE发生的时间比CA16快。EV71接种细胞出现后，CPE出现得很快，但CA16一般要上升2次，才能出现明显的CPE。使用RD细胞分离的同时添加HEp-2细胞，可以提高肠道病毒的分离率(分离出可能引起HFMD的其他病原体，例如一些科萨奇B组病毒)。但是CA16和EV71在HEp-2细胞中不繁殖。从HFMD小儿脑脊液、血液、疱疹液等林爽标本中分离病毒具有诊断价值，但从吞咽棉签或粪便中分离病毒也无法确诊。在有上述林爽症状的患者的吞咽或粪便中反复分离为同一病毒，在周围患有相同疾病的人群中也检测到相同的病毒，如果病毒分离率远高于正常人，则有诊断的参考价值。(David aser，Northern

17、 Exposure)(b)测定人双血清标本的中和抗体效价将患者急性期血清与恢复期血清中和抗体阈值进行比较，最常用的肠道病毒感染血清学诊断方法是中和实验，用微量版权法测定抗体效价是目前人类肠道病毒抗体检测最常用的方法，具有准确性和特异性。作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清(或脑脊液)中肠道病毒和抗体的效价，通常比较急性血清和恢复期血清效价，抗体效价提高了4倍以上，证明了病毒感染。但是不明显的肠道病毒感染(看不见的感染)也很常见，所以评估检查结果时要小心。在中和实验中，一般应使用肠道病毒参考独奏(例如，圆周率、EV71原型机为BrCr周率、CA16原型机为G-10周率)，有时同时(或单独)使用临床分离株，可以获得更准确的检查结果。使用对肠道病毒敏感的细胞