第二章 培养基灭菌

1、第二章 培养基灭菌,第二章 培养基灭菌,第一节 概述 第二节 加热灭菌的基本原理 第三节 分批灭菌的设计计算 第四节 连续灭菌的设计计算,本章学习要点 1、熟练掌握培养基灭菌的意义和原理、常用的灭菌方法和相关计算设计。分批灭菌和连续灭菌的概念。理解培养基灭菌的残留定律。 2、了解培养基灭菌在发酵工业中的选用及设备流程。培养基灭菌的工程设计、培养基与设备、管道灭菌条件。理解培养基连续灭菌和分批灭菌的特点及高温短时灭菌技术原理；培养基连续灭菌和分批灭菌技术的优缺点比较及其应用。 3、了解影响培养基灭菌的因素。,教学要求：掌握培养基和设备灭菌的意义和方法。分批灭菌和连续灭菌的优缺点比较。培养基灭菌的

2、工程设计、培养基与设备、管道灭菌条件。 重点：要求深刻理解与熟练掌握的重点内容 1、常用的各种灭菌方法及在发酵工业中的选用。 2、培养基灭菌原理，分批灭菌和连续灭菌的概念。 难点：1、培养基灭菌方法的选用。 2、培养基灭菌的理论基础。,讲述的内容 第一 培养基灭菌的目的、要求和方法 第二 湿热灭菌的理论基础 第三 培养基灭菌的工程设计,一、灭菌的概念和必要性 二、灭菌的方法 三、培养基灭菌的要求 四、液体培养基灭菌的特点,第一节 概述,染菌的危害性 灭菌的方法 培养基灭菌的要求 液体培养基灭菌的特点,本节知识点：,热灭菌原理,重点：,微生物的培养过程： 培养基配制灭菌接种培养,工程上的灭菌是指

3、用物理或化学因子杀灭有生活能力的细菌营养体和芽孢或孢子的方法。 消毒是消除病原微生物的措施。 在工业中一般都笼统地称为杀菌或灭菌。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 灭菌的目的：纯种发酵。,1. 灭菌的定义 用物理或化学因素除去物品上所有生活微生物的方法。,一、灭菌的概念和必要性,从字义上来看，消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除传染”的意思。 所以，消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。,消毒（disinfection）,灭菌与消

4、毒的区别 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。 （1）低温 （2）缺氧 （3）干燥 （4）高渗 （5）高酸度 （6）防腐剂,防腐（antisepsis）,化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺类药物和中草药中

5、的有效成分等。,化疗（chemotherapy）,为什么要进行培养基灭菌？ 由于生物反应系统中通常含有比较丰实的营养物质，容易受到杂菌污染，由于杂菌的存在，会有以下各种不良后果： 1)生物反应的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降。 2)由于杂菌所产生的一些代谢产物改变了发酵液的某些理化性质，使目标产物的提取困难，造成收得率降低或使产品质量下降。 3)污染的杂菌可能会分解产物，而使生产失效。 4)发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失效。,2 必要性,3 工业上具体措施 包括： 1）使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； 3）设备应严密，发酵罐维

6、持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。,4 培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。,1.化学试剂灭菌 2.电磁波、射线灭菌 紫外线、阴极射线、X射线、射线 3.加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法） 火焰灭菌、干热灭菌、湿热灭菌,二、灭菌的方法,工业上培养基灭菌使用的方法是湿热灭菌。 湿热灭菌简便、有效、经济。,常用的化学试剂： 氧化剂：0.%0.25%KMnO4溶液、0.5%1%漂白粉溶液 醇醛类：75%酒精、0.25%新洁尔灭、10%甲醛溶液、环氧乙烷 酚类：苯酚溶液、来苏尔,1. 化学药物灭菌,利用化学试剂对微生物的氧

7、化作用或损伤细胞等进行灭菌。,利用高能电磁波、紫外线或放射性物质产生的高能粒子射线穿透微生物细胞进行灭菌。 紫外线、阴极射线、X射线、射线,2.电磁波、射线灭菌,高温致死原理：由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时，微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。,3.加热灭菌,（ 1 ）干热灭菌法 利用热空气将微生

8、物体内的蛋白质氧化进行灭菌。 灭菌条件： 160下处理60min 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内， 160170 维持12小时，即可达到彻底灭菌的目的。在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 火焰灭菌（灼烧），利用火焰直接将微生物杀死。是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。,巴氏灭菌法(pasteurization)，亦称低温消毒法，冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。,巴氏灭菌法的产生来源于巴斯德解决啤酒变酸问题的努力。当时，法国酿酒业面临着一个头疼的问题：啤酒在

9、酿出后会变酸，根本无法饮用。而且这种变酸现象还时常发生。巴斯德受人邀请去研究这个问题。经过长时间的观察，他发现使啤酒变酸的罪魁祸首是乳酸杆菌。营养丰富的啤酒简直就是乳酸杆菌生长的天堂。采取简单的煮沸的方法是可以杀死乳酸杆菌的，但是，这样一来啤酒也就被煮坏了。巴斯德尝试使用不同的温度来杀死乳酸杆菌，而又不会破坏啤酒本身。最后，巴斯德的研究结果是：以5060摄氏度的温度加热啤酒半小时，就可以杀死啤酒里的乳酸杆菌和芽孢，而不必煮沸。这一方法挽救了法国的酿酒业。这种灭菌法也就被称为“巴氏灭菌法”。,主要原理 在一定温度范围内，温度越低，细菌繁殖越慢；温度越高，繁殖越快。但温度太高，细菌就会死亡。不同的

10、细菌有不同的最适生长温度和耐热、耐冷能力。 巴氏消毒其实就是利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢，因此巴氏消毒牛奶要在4左右的温度下保存，且只能保存310天，最多16天。,现行方法 当今使用的巴氏杀菌程序种类繁多。 “低温长时间”(LTLT)处理是一个间歇过程，如今只被小型乳品厂用来生产一些奶酪制品。 “高温短时间”(HTST)处理是一个“流动”过程，通常在板式热交换器中进行，如今被广泛应用于饮用牛奶的生产。通过该方式获得的产品不是无菌的，即仍含有微生物，且在储存和处理的过程中需要冷藏。“快速巴氏

11、杀菌”主要应用于生产酸奶乳制品。,目前国际上通用的巴氏高温消毒法主要有两种： 一种是将牛奶加热到6265，保持30分钟。采用这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%99.9%，经消毒后残留的只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。 第二种方法将牛奶加热到7590，保温1516秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌的基本原则是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多的营养损失。,主要应用 主要为牛奶的一种灭菌法，既可杀死对健康有害的病原菌又可使乳质尽量少发生变化。也就是根据对耐高温性极强的结核菌热致死曲线和乳质中最易受

12、热影响的奶油分离性热破坏曲线的差异原理，在低温下长时间或高温下短时间进行加热处理的一种方法。其中，在60以下加热30分钟的方式，作为低温灭菌的标准，早为世界广泛采用。利用高温处理，虽对乳质多少有些影响，但可增强灭菌效果，这种方法称为高温灭菌（sterilization），也就是在95以上加热20分钟。巴氏灭菌法除牛奶之外，也可应用于发酵产品。,通常，市场上出售的袋装牛奶就是采用巴氏灭菌法生产的。工厂采来鲜牛奶，先进行低温处理，然后用巴氏消毒法进行灭菌。用这种方法生产的袋装牛奶通常可以保存较长时间。 巴氏消毒法也不是万能的，经过巴氏消毒法处理的牛奶仍然要储存在较低的温度下（一般4），否则还是有变

13、质的可能性。因此市场上很多出售袋装牛奶的方法是很不规范的。,巴氏消毒纯鲜奶较好地保存了牛奶的营养与天然风味，在所有牛奶品种中是最好的一种。其实，只要巴氏消毒奶在4左右的温度下保存，细菌的繁殖就非常慢，牛奶的营养和风味就可在几天内保持不变。,利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌。 灭菌条件： 121下处理30min 多数细菌和真菌的营养细胞在60左右处理510min后即可杀死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80以上的温度处理才能杀死； 而细菌的芽孢最耐热，一般要在120下处理15min才能杀死。,（2）湿热灭菌法,湿热灭菌要比干热灭菌更有效。 a.原生质在含水量高

14、的情况下易变性凝固 b.蒸汽的穿透力强,湿热灭菌效果：致死温度和致死时间 致死温度：杀灭微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下或以上灭死微生物所需时间。 热阻：微生物在某一特定条件下的死亡时间。,湿热灭菌分：a.分批灭菌 b.连续灭菌,间歇灭菌法，又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。 方法是：将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。,加压 常规加压灭菌法 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸，彻底驱尽空

15、气后将锅密闭，再继续加热至121（压力为1kgcm2或15磅英寸2），时间维持1520分钟，也可采用在较低的温度（115，即0.7kgcm2或10磅英寸2）下维持35分钟的方法。 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。,连续加压灭菌法 在发酵行业里也称“连消法”。此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。培养基一般在135140下处理515秒钟。,连续加压灭菌法优点 因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率，比“实罐

16、灭菌”（120，30分钟）提高产量510； 由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率； 由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； 适宜于自动化操作； 降低了操作人员的劳动强度。,高温对培养基成分的有害影响及其防止,消除高温有害影响的措施 （1）采用特殊加热灭菌法 （2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并； （3）对含Ca 2+或Fe 3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀； （4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在112即0.57kgcm2或8磅英寸2

17、下灭菌15分钟）或间歇灭菌； （5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌,灭菌设备l、高压蒸汽灭菌 生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多 手提式灭菌锅，容量小，多用于某种培养基灭菌。 立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。 灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋)。但投资太大，适合大型菌种场使用。,立式灭菌锅,2、常压蒸汽灭菌锅 常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过500公斤。 3、烘箱 烘箱主要

18、是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。,三、培养基灭菌的要求,培养基灭菌程度：因发酵系统而不同 （1）达到要求的无菌程度（即可以接受的范围） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,培养基灭菌需解决的问题： 灭菌的温度 灭菌的时间,四、发酵工业培养基灭菌的特点,数量多 含有很多固体物质 有利于生产菌的生长 方便易行价格便宜,培养基灭菌应采用高温蒸汽灭菌湿热灭菌,湿热灭菌的优点 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽

19、有很大的潜热； 操作方便，易管理。,培养基湿热灭菌需解决的工程问题 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： 杂菌孢子的热死灭动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,第二节 加热灭菌的基本原理,一、相关概念 二、微生物的热死原理对数残存定律 三、灭菌温度与菌反应速度常数的关系 四、影响培养基灭菌的因素,本节知识点：,致死温度、致死时间、热阻 微生物的热死原理对数残存定律 菌温度与菌反应速度常数的关系 影响培养基灭菌的因素,重点：对数残存定律 难点：灭菌温度与反应速度常数的关系,一、

20、相关概念 致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所需要的时间。 微生物对热的抵抗力用“热阻”表示。热阻指微生物在某一条件下的致死时间。 营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。 相对热阻：在相同条件下两种微生物热阻的比值。,二、微生物的热死灭动力学方程,湿热蒸汽冷凝时释放大量潜热，并具有强大的穿透力，在高温和水存在时，微生物细胞中的蛋白质极易发生不可逆的凝固性变性，致使微生物在短时间内死亡。 由于湿热灭菌有经济和快速等特点，因此被广泛用于工业生产。 用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求是: 既要达到一定的灭菌程度， 又要尽量减少营 养成分的破坏。,微生物的热死原理对数

21、残存定律,对数残存定律热死灭动力学方程 某些分子的分解和分子内部的重新排列的反应属于单分子反应。杂菌虽然是一个复杂的高分子体系，但其受热被杀死，主要原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属与单分子反应。故在一定温度下，微生物受热死亡符合单分子反应动力学。在灭菌过程中，活菌逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而逐减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比，即对数残存定律：,死亡速率,残存活菌数,灭菌时间（min）,热死速度常数（杀菌速度常数）,与菌的种类和加热温度有关（min-1）。是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。K值俞小，则此微生物俞耐热。,N0-灭菌开始(t=0)时，原有活菌数（污

22、染度) N -经过灭菌时间t后残存活菌数,积分,将存活率与灭菌时间t在半对数坐标纸上标会可以得到直线。直线的斜率为K， K值越大表示微生物越容易死亡。,存活率,T一定，K随微生物种类不同而不同。 如，在121，枯草芽胞杆菌FS5230的K：0.0470.063s-1；梭状芽胞杆菌PA3679的K：0.03 s-1；嗜热脂肪杆菌FS1518的K：0.013 s-1。 同一种微生物，营养细胞和芽胞的K值也有很大的差别，营养细胞易于受热死亡，K值很高。120灭菌K值可大致为1010（min-1）数量级，而细菌孢子的K值在120只有100数量级。表2-1。,三、比热死亡速率常数,1、微生物的种类,K=

23、f（菌种，温度）,实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学与营养细胞的有所不同。它表现为非对数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。但当温度超过120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡动力学即符合一级反应规律。,判断题,对于同一种细菌，它的K（比热死亡速率常数)是固定的。 细菌孢子的比热死亡速率常数比营养细胞的大。 温度越高，细菌的比热死亡速率常数越低。,1/10衰减时间D值： 活得微生物在受热过程中减少到原来数目的1/10 (N/N0=1/10)所需要的时间。即有,D与K成反比。,Arrhenius方程: K=Ae- E/RT 或 lnK=-E/RT +l

24、nA E活化能（J/mol），其值俞大，k值越低，微生物不易死亡 K菌死亡的速度常数（1min）， A阿累尼乌斯常数，也称频率因子（1min），因菌种不同而异 R气体常数（8.36JK.mol） T绝对温度（K） （273.15）,2 灭菌温度与K的关系,E活化能（J/mol）。 其值俞大，k值越低，微生物不易死亡。 不同菌的活化能不同。 两边取对数得：,对ln K = E /RT + ln A 两边求T的导数 = ， 和E的关系：E越大， 越大,细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏反应的E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ l

25、n(N/N0 ) =K t ）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分的破坏量在允许的范围内。,1、营养成分的保持 培养基成分受热分解的反应也属一级反应，符合对数残存定律和阿氏方程： K 营养物破坏的反应速率常数（min-1） C 营养物浓度（mol/L） E 营养物分解反应的活化能（J/mol）,四、影响培养基灭菌的因素,通常E比E大很多。化学反应动力学指出：在活化能大的反应中，反应速率随温度变化也大。故当温度升高时，杂菌死亡速率要比营养成分破坏速度快得多。故采用HTST方法，可以减少营养成分破坏。,灭菌的目的：有效杀灭杂

26、菌，同时尽可能降低对营养的破坏程度。,2、微生物的耐热性 3、pH值 4、培养基成分 5、泡沫 6、颗粒,嗜热脂肪芽胞杆菌孢子和维生素B1的热处理数据（一定T下， ln(N/N0 ) =K t ），就不同的T，求得前者的比热死亡速率常数KBS和后者的比破坏速率常数KVB，按lnK1/T标会，得图，,分批灭菌的例题,由图算出： EBS=670004.184 J/mol EVB=220004.184 J/mol ln K = - E /RT + ln A 根据上图，若把灭菌温度从105（1/T=2.6410-3） 提高到127（ 1/T= 2.5010 -3 ），则KVB从0.02min-1增大到

27、0.06 min-1，KBS从0.12增大到40.0 min-1，也就是说，灭菌温度提高了22，嗜热脂肪芽胞杆菌孢子的比热死亡速率增大330倍，而维生素Bd比热死亡速率仅仅增加了3倍。,培养基灭菌的工程设计,无菌的标准 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3,一、分批灭菌的操作 二、基础条件的确定 三、灭菌效率的计算 四、分批灭菌的讨论,第三节 分批灭菌的设计计算,分批灭菌的操作过程 分批灭菌时间的计算 操作时间的计算,本节知识点,重点：分批灭菌的操作和计算 难点：分批灭菌的操作和计算,一、分批灭菌的操作 间歇灭菌（实罐灭菌、实

28、消） 将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备（一般是发酵罐）一起进行灭菌，也称实罐灭菌。这种方法不需专门的灭菌设备，在发酵罐中进行，灭菌效果可靠。分批灭菌对蒸汽的压力要求较低，在34105Pa（表压）就可满足要求，但在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。,间歇灭菌的优缺点 优点：1. 设备投资较少 2. 染菌的危险性较小 3. 人工操作较方便 4. 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点：灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,保证间歇灭菌成功的要素

29、 内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。,发酵罐的接管图,二、基础条件的确定 1、污染度N0 一般假定位104106个/ml 2、灭菌度N 实际计算时取N 10-3，即处理1000只有一个或微生物（一般是针对周期长，成本高的发酵）。 3、N/N0 为灭菌程度的指标。 例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐，则N0/N = (100106105 /10-3) = 1016，为计算方便，取 ln(N0/N )=36.8 分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却

30、的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。 Ln N0/N =36.8是总的判据，是由升温、保温、 降温三段实现的。,4、污染菌的热死特性 要了解是否符合对数残留定律，确定K，A，E的值。对不同细胞，选取不同的T和t。 5、培养罐中温度与时间的关系 大量培养液分批灭菌时，加热和冷却时 间不能忽略。总灭菌时间等于升温、保温和降温三段时间之和。 t=t1+t2+t3,三、灭菌效率的计算 若灭菌温度恒定为T，那么到规定灭菌度（N） 所需杀菌时间 当灭菌随时间变化时，K也变化，则有 积分,用V表示灭菌效果，则有 V总ln(N0/NS)=V加+V保+V冷 升温、维持和冷却过程中灭菌效果分别为,加

31、热和冷却后积分，简化得公式，P146页,例如：某发酵罐分批灭菌最高温度120，保持5min，设计的温度和时间关系如下：发酵罐100m3，N0=105个/ml，N=10-3 ，已知升温和冷却的灭菌效果不超过总灭菌效果的25%，问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？（A=7.941038min-1；E=278441J/mol;R=8.28J/molK）,实际生产上，培养基直接蒸汽加热和间接冷却的计算。P12,工业规模的灭菌操作，完成整个灭菌周期的时间是35h，各阶段的贡献大致如下： V加/V总= 0.2 V保/V总= 0.75 V冷/V总= 0.05,四、分批灭菌的讨论,温度和压

32、力的关系 泡沫问题 投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在罐壁上残留的问题 灭菌结束后应立即引入无菌空气保压,培养基间歇灭菌过程中应注意的问题,一、连续灭菌概念 二、连续灭菌流程 三、连续灭菌计算 四. 连续灭菌反应器的流体流动模型,第四节 连续灭菌及其计算,连续灭菌的工作原理 连续灭菌的工艺流程 连续灭菌时间的计算 连续灭菌反应器设备及计算,本节知识点：,重点：连续灭菌的工艺流程、设备及计算 难点：连续灭菌计算及应用,一、连续灭菌概念 连续灭菌（连消）：培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发酵罐的杀菌方法。 连续灭菌的优缺点： 优点 保留较多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 糖受蒸

33、汽的影响较少；,缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大，容易造成污染。,二、连续灭菌流程 1、连消塔喷淋冷却流程 设备庞大，易发生局部受热不均。,2、喷射加热真空冷却流程 加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏少。,典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图,3、薄板换热器连续灭菌流程 培养基在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程。,薄板换热器连续灭菌流程,薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图,4、连续灭菌设备的结构,套管式连消塔,喷嘴式连消塔,维持罐,喷射加热器,薄板换热器,直接蒸汽连续灭菌设备温度和时间的关系。由于加

34、热和冷却时间极短，可省略。灭菌时间主要是维持器中停留时间。故只有维持器的设计与灭菌程度有关。 已知灭菌温度，理论灭菌时间可按下式估算： 杀菌速率常数K可取普通耐热细菌芽孢的K值，并按下式计算：,三、连续灭菌计算,= 式中：V反应器中液体所占的体积（L，m3） Q通过反应器的流体流速（L/min，m3/min）， 为流体在反应器中停留的时间。 在设计连续灭菌设备时，必须认识到并不是培养基的每一质点都在反应器中停留同样的时间。,四. 连续灭菌反应器的流体流动模型,实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点 （微团）的流速不同（有流速分布）。 实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团

35、）的流速不同（有流速分布），这就必然造成物料间的（轴向）混合，（由于有返混现象）这样就不能保证物料先进的先出，后进的后出，那么有的物料灭菌时间长，有的灭菌时间短，有的物料达到了灭菌要求，而有的没有达到，由此我们在设计反应器时，一定考虑到这个现象，引入的概念。 返混现象 ：反应器中停留时间不同的物料之间的混合称为返混。,按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型： 连续搅拌罐（CSTR）：返混为 活塞流反应器（PFR）反应器：返混为0,（1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactor 活塞反应器是指反应器中物料的流动状况满足活塞流假设，物料沿同一方向以相同速度

36、向前流动，在流动方向上没有物料返混，所有物料在反应器中的停留时间都是相同的。（长径比很大的管式反应器，没有弯头、阀门、管件、接近于PFR模型） 灭菌状况：在PFR内进行恒温热灭菌，沿流动的方向，活孢子的浓度N下降，热死灭速率也相应下降，但对于同一截面上活孢子浓度相等，热死灭速率也相等；沿流动方向，活孢子浓度及热死灭速率相应下降，下降的规律决定于菌体死灭反应动力学。,对反应器进行物料衡算有通式如下： 进入量=排出量+反应量+积累量 积分ln =Kt 结论：活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分批灭菌效果相同，反应速度增加，但是可以节约升降温的时间。常把PFR反应器用于升至灭菌温度后的恒温热灭菌。,搅拌

37、强烈的实际连续反应器（机械搅拌、气流或液流搅拌）可以接近于CSTR特性。 那么这样反应器的N、N0、t、k等参数之间的关系是怎样的数学表达式呢？ 因为整个反应器内浓度分布均匀，所以对进出整个反应器的物料活菌数进行物料衡算。 进入量=排出量+反应量+积累量 QN0 = QN + KNV + 0 整理 QN0=N（Q+KV）,（2）CSTR模型（全混流模型）,返混：是不同反应时间的物料之间的混合。 PFR：返混程度最小 CSTR：返混程度最大 高/径，返混程度；高/径，返混程度 实际的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间，象塔式，短管式反应器，都存在一定程度的返混。,3）扩散模型,流体在管内流

38、动，由于分子扩散和涡流扩散的作用使一部分流体质点返混了回去，这个过程简化为在活塞流动中叠加了一个与流动方向相反的扩散。 费克定律： 扩散通量（沿轴方向）=De De：轴向扩散系数，cm2/s C：质点浓度，个/cm3 L：扩散距离，cm ,培养基的灭菌条件 1、培养基的性质： 体积、培养基成分的可溶性 2、加热和冷却阶段灭菌效果 加热灭菌的技术要点,第五节 灭菌问题的讨论,培养基成分对灭菌的影响 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。 培养基的物理状态对灭菌的影响 培养基中微生物数量对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响 培养

39、基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。,影响灭菌的因素,微生物细胞中水分对灭菌的影响 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 空气排除情况对灭菌的影响 搅拌对灭菌的影响 泡沫对灭菌的影响,在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这些料液都必需经过灭菌。 灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。 如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。 也有利用过滤法对另补料液进行除菌。 补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。 所有的附属设备和管道都要经过灭菌。,习题 1.常用的灭菌方法有哪些？发酵工业中为何应用最广的是湿热灭菌？ 2.将10000千克的培养基在发酵罐内进行