PCR技术以及常见问题解析

1、PCR技术应用和常见问题分析，南京凯吉生物技术开发有限公司，郭强分子平台负责人，目录，基因表达研究背景传统PCR技术(链聚合酶反应)PCR反应系统和反应程序PCR常见问题分析实时定量实时定量PCR(实时定量PCR)实时定量PCR mRNA小细胞nuclearRNA、snRNA、kaiji生物技术开发有限、净作用因素、基因表达研究策略、保姆基因：house-keeping gene是所有细胞中表达的基因种类微管蛋白基因等。高级基因：Luxury gene是在特殊细胞类型中大量(通常)表达并编码特殊功能产物的基因，具有组织特异性。kaiji生物技术开发有限公司，3，基因表达研究战略，kaiji生物

2、技术开发有限公司，基因表达研究战略，cDNA:complementary DNA，RNA链的补充单链DNA，RNA在适当的引物存在下依赖RNA的DNA聚合，EST/mRNA，Genomic，扩展，变性，退火，keki生物技术开发有限公司，PCR技术(聚合酶链反应)，PCR反应循环，keki生物技术开发有限公司，PCR反应系统/程序曲线，PCR brkeki生命技术开发有限公司，(4)dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度，4种dNTP浓度必须相同浓度过高，才能容易产生错误碱基的混合，浓度过低，将反应产量dNTP与Mg2结合，会降低游离Mg2浓度，影响DNA聚合酶的活性。kaiji生物技术开

3、发有限公司，(5) Mg2，Mg2是DNA聚合酶激活剂。适当浓度为0.5-2.5mmol/L反应体系。如果Mg2浓度过低，Taq酶活性丧失，PCR产量下降。Mg2过高会影响反应特异性。Mg2可以与负离子结合，因此反应系统的dNTP、EDTA等浓度影响反应中自由的Mg2浓度。凯吉生物技术开发有限公司，2)由于循环参数变性，双股DNA分解线由单股94，20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度会减少引物和模板的非特异性结合。降低温度会增加反应的敏感性。凯吉生物技术开发有限公司，(3)扩大70-75，一般延长72个时间由放大片段长度决定，(4)循环次数主要是模板DNA的浓度一般超过

4、25-35次：放大效率降低错误混合率增加，凯吉生物技术开发有限公司，PCR常见问题解答： 具有非特异性条带、引物和模板的非特异性退火基因特异性引物设计不良RNA中具有基因组DNA的污染，在引物二聚体镁离子浓度过高，提高反应温度和特异性的引物中，特异性扩增水平DNase处理RNA设计三端互补序列的引物中，优化镁离子浓度M 1 2，kaiji生物技术开发有限公司，引物设计：(1)序列高度保守(2)底漆长度15-40 BP为宜。(3)碱尽可能随机分布，G C占40-60%。(4)引物内部避免了二次结构的形成。(5)两个引物之间防止互补序列。(6)引物的3端是核心碱基。第5团没有严格的限制。kaiji

5、生物技术开发有限公司，分散(SMEAR)条带生成，第一链产品含量过高的PCR反应中引物过量循环数过多的退火温度过低，因核苷酸片段引起的非特异性放大，减少第一链产品量的现有PCR阶段中引物量，PCR的循环将组织或细胞的总RNA提取RNA逆转为cDNA，目的基因引物设计为PCR，琼脂糖电泳和数字照片分析电泳带灰度值，判断目标基因mRNA转录水平的相对变化，RT-PCR反应示例，RT-PCR引物的选择：1。 随机引物2。Oligo dT 3 .基因特异性引物，RT-PCR例：一，学习实验目的RNA提取方法；学习PCR分析的原理和技术。后代肾小管上皮细胞CTGF

6、基因表达分析药物处理，凯吉生物技术开发有限公司，第二，实验材料，工具和试剂1。材料：人肾小管上皮细胞等样品组织2。工具：微吸管和吸头、PCR仪器和PCR管琼脂糖凝胶电泳设备、DEPC水等3。试剂：Trizol试剂(kaiji)RT-PCR套件(keki kit)，kaiji生物技术开发有限公司，1。RNA萃取参考RNA萃取套件指示，3，操作步骤，2。RNA质量测定，280，320，230，260纳米以下的吸光度分别表示核酸、背景、盐浓度、蛋白质等有机物的值。OD260/OD280(Ratio，R) 2.2 RNA分解，凯基生命技术开发有限公司，3 .rt reaction，RNA 2-4ug

7、XUL oligo dt 10um 1.5 ul depc water to 10 ul，70水浴10分钟，冰浴5分钟，添加以下成分：RNA inhibitor 40u/ul 0.5 ul 10 x AMM，凯基生物技术开发有限公司4。PCR Reaction，10 X PCR反应缓冲2.5 L 25 mmol/L MGC L 2.0 L 10 mmol/L dntp 1.0 l 10 mol/l引物1.0 L 10mol/L引物2.0 L DNA 1.0 L Taq 0.2 L(5U目前，实时定量PCR是一种非常有效的实验方法，广泛应用于分子生物学研究的各个领域。kaiji生物技术开发有限公

8、司，real time PCR and conventional PCR，vs，1。实时在线监控：监控样品放大的全过程，实时观察产品增加，直观地查看反应的对数周期，2 .降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针，结合模板特异性，提高PCR反应的特异性，3 .增加数量特异性：全面监控，用精确算法量化；结果分析快速方便，无需执行，凯基生命技术开发有限公司，荧光定量PCR与现有PCR技术的区别，现有PCR是通过电泳定性分析放大反应的最终产物(定量不准确)；荧光定量PCR是在PCR反应系统中添加荧光组，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，使每个周期“可视化”(or cDNA)的起始浓度通过Ct值和标

9、准曲线量化(精确定量)的方法。，kaiji生物技术开发有限公司Realtime PCR 25(4) :386-401.3。高性能模型of congenital tox oplasmis in guinea-pigs : use of quantitative and qualifitative PCR for the study of materno fet altransmisa quantitative real-time PCR method for detection of B- lymphocyte monoclonal ity by comparison of kappa and

10、lamb da immunoglobulin light chai N expressAnders sthlberg，clinical chemistry 49(1): 51-59，多实时荧光定量PCR，双链DNA特异染料(SYBR)是一个反应管中多用途产品荧光染料LUX这些荧光组的荧光发射波长不同，可以分辨引物介导的放大产物。发夹引物，单链引物，扩展引物dsDNA，keki生物技术开发有限公司，Dyes Used for Real-Time PCR，Dyeexitation maximum(nm)emission maximum第二，材料实时定量PCR试剂：1。ABI TaqMan PCR核

11、心套件2。ABI SYBR PCR核心套件，kaiji生物技术开发有限公司，第3阶段，方法1。SYBR greenkit的实时PCR，2 .实时定量PCR仪器设置，凯吉生物技术开发有限公司，阶段时间温度注意事项UNG(可选)防止残留2分钟50ung启动PCR产品中所有dUMP污染物PCR的初始激活阶段15min 95激活HotStarTaq DNA聚合酶3(4)-阶段循环：变性15s 9435-40个循环取决于起始模板DNA量。kj生物技术开发有限公司，实时PCR问题分析，Q1:没有Ct信号1。反应循环参数不足，通常需要循环35个以上，但是如果太多，可以增加背景值。荧光信号检测阶段无效。SG方

12、法采用72扩展诗集获取，这是退火结束或扩展结束时发生的TaqMan法则。引物或探针分解，页面检测完整性。引物或探针的设计，如果探针没有足够高到引物的温度，探针就不会杂交，产品开始扩展。4.模板不足5。模板分解，凯基生命技术开发有限公司，Q2: CT值出现得太晚1。放大效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，提高镁离子浓度。2.反应成分分解或样品采集不足3。PCR产物太长，一般为80-150bp，凯基生命技术开发有限公司，Q3:标准曲线线性关系不良1。样品佛像坡度2。标准物分解，防止反复董洁融化3。底漆或探针设计不良4。模板中有抑制剂或模板浓度太高，凯基生命技术开发有限公司，Q4:溶解曲线存在多个主峰1。底漆设计未充分优化2。底漆