实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告

1、实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告,卫生部临床检验中心 李金明,基本概念,线性基线期 (Linear base-line phase) 为PCR扩增的四个主要阶段之一（图）。线性基线期为扩增最初的1015个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低，因此，基线荧光信号可根据此阶段产生的荧光信号来计算。,基本概念,指数期初期 （The beginning of exponential phase） 为PCR扩增的四个主要阶段之一（图）。进入扩增指数期初期，荧光强度达到一个阈值，该阈值通常为基线荧光信号均值标准差的10倍。扩增达到阈值时的循环数可称为CT（ABI

2、 Prism有关文献）或CP（LightCycler有关文献）。CT或CP与原始扩增模板数量正负相关，可通其与原始模板的函数关系，来计算原始模板的数量。,基本概念,指数期（Exponential phase） 为PCR扩增的四个主要阶段之一（图）。PCR达到其最大的扩增阶段，理想条件下，每一循环后，PCR产物倍比增加。,基本概念,平台期（Plateau phase） 为PCR扩增的四个主要阶段之一（图5-1）。扩增达到平台期，此时，荧光信号不再随扩增循环数的增加而增加。,基本概念,Ct值（threshold cycle）或CP值（crossing point） Ct或CP值指的是实时监测扩增过

3、程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前3到15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数（Ct）。有实验证明Ct值与样本中的原始拷贝数成正比关系。Ct值是当前实时荧光PCR的主要定量参数。,基本概念,扩增效率E（amplification efficiency） 扩增效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值，其值位于0到1之间。在PCR的前20或30个循环中，E值比较恒定，为指数扩增期，随后E值逐步降低，直至0，此时PCR达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值与所得Ct值做图，

4、在一定范围内应该是得到一条直线，利用公式（1）：E=10-1/K-1（K为该直线斜率）即可计算出E值。,基本概念,绝对定量（Absolute quantitation） 绝对定量是使用一系列稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标准品的Ct值与起始模板（RNA或cDNA）量之间的线性比例关系，绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值，从标准曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度应包含临床标本的浓度范围，并且在实时PCR仪及检测试剂方法的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是RNA，也可

5、以是双链DNA片段、单链DNA或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与RNA标准品相比，DNA有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录没有关系，不能反映逆转录效率。,基本概念,相对定量（Relative quantitation） 在相对定量中，标本中特定mRNA的测定是建立在外标或参比样本（校准品）的基础上的。当使用校准品的时候，定量测定结果可表示为靶RNA/校准品比值。有多种数学模型可用来计算相对定量测定的平均正态化的基因表达。使用不同的数学模型所得到的结果和标准差均会有所差异。表5-1比较了不同的数据处理方法及其解释。,基本概念,标准品（Standard） 用来构建标准曲线的已知

6、浓度的样本。 参比（Reference） 用于对检测结果进行标准化的被动（Passive）或主动（Active）信号。如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性参比意味着信号由PCR扩增所致，主动性参比有其自己的引物和探针。被动性参比则为非PCR所致，如ROX染料，可以校正荧光信号的非PCR波动。,基本概念,内源性内标（Endogenous control） 为一个出现在每一个实验样本中的特定RNA或DNA，通过使用内源性内标这种主动性参比，对于加入到每一个反应中的总RNA量的差异，其可以校正靶mRNA的定量。 外源性内标（Exogenous control） 为一个以已知浓度加入至每个样本中的

7、特性确定的RNA或DNA，外源性主动性参比通常为体外构建的，可作为内阳性质控以鉴别由PCR抑制所致的假阴性。外源性参比也可用来校正样本提取或cDNA逆转录合成的效率。,实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型,在实时荧光PCR中，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。,实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型,利用已知起始拷贝数的外部标准品可做出标准曲线，在现有实时荧光PCR中，大部分以纵坐标为Ct值，横坐标为起始拷贝数，少部分以纵坐标为起始拷贝数，横坐标为Ct值。,实时荧光PCR外标绝对定量的数学模型,只要获得未知标本的Ct值，即可从标准曲线上计算出该标

8、本的起始拷贝数，这是采用外标进行实时荧光PCR绝对定量的基本原理。,基本计算公式的推导,Yn = X ( 1+E )n (1) 其中，Yn 为第n个循环后扩增产物的量，X为原模板数，E为扩增效率，n为扩增循环数。 在扩增达到阈值线时，此时，n = Ct，于是，扩增产物的量为： YCt = X ( 1+E )Ct (2) YCt 为荧光信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它就是一个常数。（2）式两边同时取对数，得： Log YCt = LogX ( 1+E )Ct (3) 亦即：Log YCt = LogX +CtLog ( 1+E ) （4）,基本计算公式的推导,如果扩增效率为1

9、00%，亦即E=1，扩增反应管中原始拷贝数为10，扩增产物达到1000分子拷贝，则预计的Ct = （Log 1000 -Log 10）= 2 = 6.64。因此，如果已知原始模板拷贝数为1，扩增产物达1000分子拷贝时，其Ct 6.64较多，则说明扩增效率过低。,纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct值时的数学模型,重新重理（4）式 Log YCt = LogX +CtLog ( 1+E ) 可得： LogX = -CtLog ( 1+E ) + Log YCt (5),纵坐标为起始拷贝数对数值横坐标为Ct值时的数学模型,根据Y= AX+B，（5）式中的Y = LogX，X = Ct，A = -

10、Log ( 1+E )，B = Log YCt 从A = -Log ( 1+E )中，可计算PCR反应的扩增效率E = 10-A-1 （6） 如果 A = -0.301，代入（6）式可得：E = 1，即扩增效率为100%。 如果 A = -0.201，代入（6）式可得：E = 0.589，即扩增效率为58.9%。 这样可以判断是否需要优化反应条件。此时，斜率A必-0.301。 截距B = Log YCt ，其与阈值线的选定直接相关，应为Ct值趋向于0时的原始模板拷贝数的对数值。,纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型,纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型,LogX = -CtLo

11、g ( 1+E ) + Log YCt (5) 可变换为: Ct =( -1/log(1+E) Log X +Log YCt / log(1+E) (7) A= -1/log(1+E), B= Log YCt / log(1+E) 如果扩增效率为1（100%），则斜率A =-1/log2=-3.32 如果扩增效率为0.5（100%），则斜率A =-1/log1.5=-5.68,纵坐标为Ct值横坐标为起始拷贝数时的数学模型,此种计算模式下，斜率A必-3.32。 截距B则为原始模板趋向于0亦阴性标本检测的Ct 值，因此，一个实时荧光PCR，如果设定的扩增循环数为40，则其截距B即应40。,日常扩增

12、的实时荧光曲线所蕴含的信息,定量和定性PCR测定的临床应用及应注意的问题,为什么要做定量测定？ 定性和定量测定结果报告上的混淆。,为什么要做定量测定？,用于已知病毒感染患者抗病毒治疗效果的动态观察及抗病毒药物的临床研究； 用于基因表达方面的研究，如特定的mRNA的定量测定。,为什么要做定性测定？,用于未知患者的确认 用于血液筛检 突变检测,定量和定性测定的结果报告,定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未知病人的确认诊断。 定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围，则可报告多少，也可对样本稀释后再检测；如低于此范围，则报告多少