ELISA所需缓冲液的配方#培训学习

1、首先，做酶联免疫吸附试验来确定抗原的最佳包被浓度，以及如何做平方滴定？选择一个已知阳性和阴性背景的样品，用1*CB PH=9.6或1*PB PH=7.4 (8种条件)稀释您的抗原，然后将其添加到每孔100毫升的96孔板中。(通常，包被浓度为100ng抗原或抗体/孔，最佳包被条件需要通过实验来选择。4)取出过夜，甩干，加入20%的丁腈橡胶，密封每孔200微升。在37下热密封2小时，将其扔掉并拍干。用酶标记的稀释液(4倍稀释梯度)稀释你的辣根过氧化物酶标记的抗原或二抗。棋盘滴定法是平板酶交叉试验，阳性和阴性同时进行，通过实验确定了最佳的磷氮涂层2.抗原和抗体最佳工作浓度的确定抗原抗体反应需要在最佳

2、比例下进行。酶联免疫吸附试验的试剂很多，不同的工作浓度对结果影响很大。因此，必须滴定和选择包被抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)的最佳工作浓度，以达到最佳测定条件。1)通过正方形矩阵(棋盘)滴定选择包被抗原的工作浓度经过一系列稀释(1:50 :800)，抗原被包被并逐行洗涤。加入用稀释剂1:100和稀释剂(空白对照)稀释的强阳性、弱阳性和阴性参考血清，保温并洗涤。加入具有工作浓度的酶标记抗体，洗涤，加入底物显色，加入酸终止反应，然后读取数值。选择一个强阳性参考血清值；约为0.8，用阴性参考血清稀释包被抗原的A值为0.1时为工作浓度。包被抗体和酶标抗体的工作浓度采用正方形矩阵(棋盘)法选择。用10毫

3、克/升、LMG/升和0.1毫克/升的三种浓度包被抗体，每种浓度包被三排(每排3个孔)。将强阳性抗原、弱阳性抗原和阴性对照分别加入到涂有各浓度的第一、第二和第三排中，用稀释剂将酶标记的抗抗体稀释至10。加入底物显色，加入酸终止反应，分别读取A值。最佳条件是强阳性抗原溶液的A值约为0.8，阴性参考A值为0.1。因此，选择包被抗体和酶标抗体的最佳工作浓度。二是酶联免疫吸附试验最佳工作浓度的选择及其标准化操作1最佳工作浓度的选择1.1间接测量抗体的方法酶标抗体工作浓度的选择：包被IgG，洗涤。酶标抗体用稀释液稀释一系列，然后分别加入包被孔中，保温洗涤。加入酸终止反应后，读取吸光度(a)。当A值为1.0

4、时，读取酶标抗体的稀释度作为酶标抗体的工作浓度。酶标IsC的工作浓度应为1/1600。棋盘滴定法选择包被抗原的工作浓度：用包被液稀释1: 50的抗原，包被，洗涤。用稀释液以1: 100稀释强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清，加入样品，保温洗涤。加入按工作浓度稀释的酶标IsC抗体，保温洗涤。添加底物显色。加入酸停止反应，然后读取数值。选择强阳性参考血清的A值约为0.8，阴性参考血清的A值小于0.1的包被抗体稀释液作为工作浓度，并选择最佳工作浓度。1.2抗原测定的夹心法在夹心酶联免疫吸附试验中，包被抗体和酶标抗体的工作浓度可以通过棋盘滴定法同时选择。用包被缓冲液将抗体免疫球蛋白稀释至蛋白

5、浓度为10.0、1.0和0.1 g/ml，分别包被于酶联免疫吸附板，每种浓度包括3个柱，并洗涤。在一个水平行的每个涂膜孔中加入强阳性抗原溶液，在另一个水平行加入弱阳性抗原溶液，在第三个水平行加入阴性对照溶液，保温洗涤。将酶标抗体稀释至3个浓度，如1: 1000、1: 5000和1: 25000。将它们添加到每种涂料浓度的一个垂直行中，保持温度并清洗它们。添加底物显色。加入酸停止反应后，读取A值。以强阳性抗原的A值约为0.8，阴性对照的A值小于0.1为最佳条件，选择包被抗体和酶抗体的工作浓度，从中选择包被抗体的浓度和酶标抗体的稀释度。为了进一步节省试剂，该浓度可以用作基点，并且间隔可以减小，并且

6、可以进行进一步的棋盘滴定。2测定方法的标准化2.1样品添加除涂层外，酶联免疫吸附试验通常需要96孔取样。在定性测定中，有时不强调样品添加的准确性。例如，规定应添加一滴样品。如果没有同等条件，应尽量使用同一口径的滴管，并保持准确的取样姿势，使每一滴液体的体积基本相同。定量测定时，加样量应准确，最好使用测量范围准确的微量移液器。添加样品时，液体应添加到孔的底部，而不是孔壁的上部，以避免气泡。2.2绝缘在酶联免疫吸附试验中，一般情况下，加入样品和偶联物后，反应温度和时间应符合规定要求，保温容器最好是一个能快速平衡温度的水浴箱。酶联免疫吸附板不应叠放在一起。为了避免蒸发，板应该被覆盖或平放在底部有湿纱

7、布的湿盒子里。如果使用培养箱，应该事先放一个空的湿箱来平衡温度。2.3清洗洗涤不是酶联免疫吸附试验中的反应步骤，但却是实验成功的关键。在样品和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨醇酯可以避免非特异性吸附，这是酶联免疫吸附法中最常用的方法。以下方法通常可用于洗涤酶联免疫吸附试验板：(1)将反应溶液吸干；用洗涤液填充板孔；静置2分钟，轻轻摇动；排出孔中的液体，或者倒出液体，轻拍在吸水纸上。洗涤次数通常是3-4次，有时甚至是5-6次。如果有专门的洗衣机，应制定标准的洗涤程序，并定期检查洗涤液，以确保洗涤质量。2.4颜色比较阴性对照的颜色很浅，因此目视比色法通常可用于定性测定。在目测法中，待测血清与抗原

8、之间的对照反应孔和待测血清与特异性抗原之间的反应孔是无色的。文章来源：或中国文化网的极淡色彩，被判定为负面；待测血清与抗原之间的反应孔为无色或极浅，而带有特异性抗原的反应孔为橙色，则判定为阳性。如果用比色计测量结果，其准确度取决于酶联免疫吸附试验板底部的光滑度和透明度以及比色计的质量。3.如何用酶联免疫吸附法测定抗原包被浓度？酶联免疫吸附试验中抗原包被浓度的确定。可以看出，在一些数据中，抗原和血清稀释的最佳条件是强阳性抗原溶液的A值约为0.8，阴性参考A值为0.1。为什么选择这个作为最好的条件？弱阳性血清有什么用？当探索涂层浓度时，血清中的抗体含量是固定的

9、吗？您需要预先设置该值吗？迫切需要答案一般来说，当我们这样做的时候，有抗原和抗体两个变量。抗原的浓度是根据抗原的纯度来决定的。通常，纯化的蛋白质是2ng。有时候，t就我个人而言，我认为选择OD1.0作为棋盘酶联免疫吸附是一个错误。首先，不同模型的灵敏度应该不同；其次，1.0的OD值是指在一定的抗原抗体浓度下的OD值，这并不意味着由该棋盘获得的具有最佳抗原抗体浓度的各种后续ELISA实验的值也是大约1.0，因此在微孔板阅读器的灵敏度中选择最佳条件不一定符合后续的实验。(糟糕的表达，我不知道我是否已经描述清楚了)我认为我们应该根据不同的实验类型(间接、双抗体夹心或竞争等)选择最佳的抗原和抗体浓度。

10、)。与竞争酶联免疫吸附试验一样，制作棋盘的目的是包被一定量的抗原和一级抗体。想象一下，如果包被抗原太厚，这意味着竞争抗原的浓度不应该很低(毕竟，竞争对手不能太不同)，这就注定了竞争酶联免疫吸附试验的检测限很差(因为竞争抗原往往是需要检测的东西，所需浓度越大，IC50就越大)。然而，一级抗体是不够的，否则它既能与包被抗原反应，又能与被检测抗原反应，因此不能称之为竞争酶联免疫吸附试验。或者太少，否则整体外径读数太低。双抗体夹心酶联免疫吸附试验也是如此，它可以找到包被抗体和酶标抗体之间的平衡点OD和背景之间的平衡。Iv .elisa试剂盒Elisa试验是一种灵敏度高、特异性强、重复性好的实验诊断方法

11、。由于其试剂稳定、易于保存、操作简单、结果客观等优点，已广泛应用于免疫学检测的各个领域。酶联免疫检测试剂盒用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人戊型肝炎病毒IgM抗体。(1)酶联免疫吸附试验简介Elisa技术流程酶联免疫吸附法的基础是抗原或抗体的固定化和抗原或抗体的酶标记。结合到固体载体表面的抗原或抗体仍然保持其免疫活性，而用酶标记的抗原或抗体保持其免疫活性和酶活性。在测定中，测试样品(其中的抗体或抗原)与固体载体表面的抗原或抗体反应。在固体载体上形成的抗原-抗体复合物通过洗涤与液体中的其它物质分离。然后加入酶标记的抗原或抗体，抗原或抗体也通过反应结合在固相载体上。此时，固相上酶的量与样品中被测

12、物质的量成正比。加入酶反应底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与样品中被测物质的量直接相关，因此可以根据颜色深浅进行定性或定量分析。由于酶的高催化效率，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法高度灵敏。酶联免疫吸附试验可用于测定抗原和抗体。但是，影响Elisa检测结果的因素很多，因此加强各个环节的质量保证可以充分发挥其方法学的优势。(2)酶联免疫试剂盒检测技术的发展临床检测技术的发展主要在于方法学的发展，方法学的发展依赖于试剂生产技术的不断进步和更新以及类型标记的应用。目前，分子生物学正在使我们对整个生命科学有一个全面而透彻的了解，它对免疫分析技术的发展也有直接而有效的影响。它使我们能够方便地

13、测量一些以前难以检测的生物活性物质，并大大提高了检测的灵敏度和特异性。(3)基因工程试剂对免疫分析技术发展的影响免疫分析技术是基于抗原和抗体之间的特异性结合反应，因此任何高质量的诊断试剂都不能从高质量的原料中分离出来，如抗原和抗体、酶等。以前，用于免疫测定的抗原通常是各种纯化的抗原，而抗体是通过用纯化的抗原免疫动物获得的多克隆抗体和通过杂交瘤技术获得的单克隆抗体，而蚂蚁的标记物乙肝表面抗原试剂特点(检测方式：临床抗体夹心法):包被抗体为山羊多克隆抗体。多克隆抗体对抗原的各种表位具有高亲和力和反应性。酶表面抗体是一种与乙肝表面抗原结合位点不同的小鼠复合单位，可检测乙肝表面抗原变异样品，提高检测特

14、异性(99.98%)和灵敏度。应用佩雷里奇理论，对ad标准的灵敏度为0.05纳克/毫升，对ay标准的灵敏度为0.025纳克/毫升。(4)试剂盒的检测原理酶联免疫检测试剂盒采用定性夹心免疫检测技术，用合成的戊型肝炎病毒多肽抗原包被微孔板条。这些多肽是中国戊型肝炎病毒株核心氨基酸序列中的高抗原性肽，分别来自该株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准加入孔中并孵育。如果其中含有戊型肝炎病毒抗体，这些抗体将与戊型肝炎病毒多肽抗原结合并固定在其上。清洗平板以去除样品中的其他非特异性抗体和其他成分。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根过氧化物酶)酶缀合物，第二次孵育后，酶缀合物将与第一次孵育中结合的HE

15、V IgM抗体结合，洗板除去未结合的酶缀合物，加入TMB底物溶液，酶-底物反应将在第三次孵育中发生，并且只有那些含有由HEV IgM抗体和酶缀合物形成的复合物的孔才会变色。加入硫酸溶液，停止酶与底物的反应，并在波长：450纳米处测量外径值。根据这种戊型肝炎病毒IgM抗体酶联免疫试剂盒的测试标准，外径值大于或等于临界值的样品在初始测试中被认为是阳性的。(5)操作步骤方法1双抗体夹心法检测未知抗原1.包被：用0.05毫克磷酸氢二砷包被缓冲液将抗体稀释至1 10微克/毫升蛋白质含量。向每块聚苯乙烯板的反应孔中加入0.1毫升，并在4下过夜。第二天，丢弃孔中的溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。(缩

16、写为washing，下同)。2.加样：将0.1毫升待检测的稀释样品加入到上述包被的反应孔中，在37孵育1小时。然后清洗。(同时制作空白孔、阴性对照孔和阳性对照孔)。3.加入酶标抗体：在每个反应孔中加入0.1毫升新稀释的酶标抗体(滴定后稀释)。37孵育0.5 1小时，洗涤。4.加入显色用的底物溶液：在37下，向每个反应孔中加入0.1毫升临时配制的TMB底物溶液10 30分钟。5.终止反应：在每个反应孔中加入0.05毫升2M硫酸。6.结果判断：用肉眼在白色背景上直接观察结果：反应孔颜色越深，阳性程度越强，阴性反应无色或极浅，根据颜色深浅用 和-表示。也可以测量外径值：在酶联免疫吸附检测器上，在45

17、0纳米(如果ABTS用于显色，则为410纳米)，用空白对照孔调零后测量每个孔的外径值，如果大于规定负对照外径值的2.1倍，则为正。方法2是检测未知抗体的间接方法1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1 10 g/ml，每孔加0.1ml，4过夜；2.第二天洗3次；3.向包被的反应孔中加入0.1毫升稀释的样品(未知抗体)，在37孵育1小时，并洗涤；4.(同时做空白、阴性和阳性对照)加0.1毫升；新鲜的和稀释的酶标记的第二抗体(抗抗体)进入反应池；在5.37孵育30-60分钟，洗涤；6.最后一次和DDW一起洗。其他步骤与双抗体夹心法的步骤4、5和6相同。(6)试剂和设备试剂(1)涂层缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液):1.59克碳酸氢钠碳酸氢钠2.93克加入蒸馏水至1000毫升(2)洗涤缓冲液(PBS，ph 7.4):0.15米0.2克k