第二章目的基因连接及导入

1、第五节基因与载体的连接，基因工程，第二，目的基因与载体的连接(连接)、质粒、DNA分子、两个切口目的基因、DNA连接酶、重组DNA分子(重组质粒)、相同的限制酶，目的基因与运输载体的连接过程，实际上是不同的(主要有以下4种连接方式)1)粘性末端连接2 )平头末端连接3 )人工连接法4 )相同多尾连接法，工具酶：基因工程中的工具酶主要包括与DNA和RNA分子的切断、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。 DNA连接酶只能催化互补粘性末端间的连接，DNA连接酶(DNA ligase )在双链DNA片段附着的3-OH末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，连接末端。 虽然能催化互补粘性末端和末端间的连接，

2、但末端间的连接效率低。 目的用相同的限制酶酶切断基因和载体，产生相同的粘性末端，在DNA连接酶作用下将两者连接构成重组DNA分子。 用、同一种或两种限制酶切断，DNA连接酶、重组质粒、质粒、目的基因、本方法适用于质粒和目的基因有同一单一或双酶切断部位的情况，(1)粘性末端连接，部分限制酶只能将目的基因和载体DNA切断成平坦的末端、质粒、平末端的内切酶、DNA连接酶、粘性末端的内切酶、核酸酶S1、目的基因、重组质粒、(2)平头末端连接、(3)人工连接方法合成连接子和DNA平头末端连接限制酶切断、产生粘性末端连接、重组接头连接，用相同的限制酶切断，DNA连接酶，重组质粒，质粒，目的基因，DNA连接

3、酶，接头，本方法适用于质粒和目的基因没有相同的酶切断部位(4)相同多尾连接法，DNA连接酶，组质粒、目的基因、内切酶、内转移酶dGTP、内转移酶dCTP，本方法适用于质粒和目的基因没有相同酶切部位的基因和载体的平端连接法吗？ (1)用T4DNA连接酶法连接平末端DNA分子的方法有两种，一种是用T4DNA连接酶直接连接平末端DNA分子，另一种是用末端核苷酸转移酶向平末端DNA分子中添加均聚体的尾后再用DNA连接酶连接。 T4DNA连接酶与一般大肠杆菌DNA连接酶不同。 T4DNA连接酶除了可以封闭具有3-OH和5 p末端的双链DNA的缺陷外，还可以在存在ATP、添加了高浓度酶的条件下，完全连接具

4、有成对碱基的平末端DNA分子，但连接效率比粘性端低。 (2)均聚物加尾法5从特殊的核酸外接酶处理目的基因和质粒的平端去除几个末端核苷酸。 可以使用末端核苷酸转移酶，向DNA分子单链延长末端的3-OH基因中添加核苷酸(通过脱氧核苷三磷酸前体)，不需要模板链的存在，一个一个地添加核苷酸，构成核苷酸组成的尾巴，长度为1 在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，向载体3OH末端延伸形成单链PolyT尾。 将两者混合互补连接，用DNA连接酶封闭间隙。 (3)用化学合成的连接物连接DNA分子，用化学合成法合成1012个核苷酸，将限制酶识别部位的低核苷酸片段磷酸化后，用T4DNA连接酶，将片段分别连接到载体

5、5侧和目的基因片段5侧。 用适当的限制酶处理，会产生互补的粘性末端。 4)T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目标基因DNA的同时，可以不依赖模板而在产物3的末端加入两个游离的a。 如果去除载体切口人工施加的游离t，PCR产物就可以连接到载体上。在、T-A克隆T-vector的两条链的五个端上含有游离的T PCR的过程中，普通的Taq酶可以在产物的三个端上添加a，1 .用一定的基因切断目标基因3 .将切出的目的基因片段插入质粒的_中，形成重组DNA分子(重组质粒)，限制酶、粘性末端、同一种类的限制酶、粘性末端、切口、DNA连接酶，同样是质粒基因组切口的基因目的基因片段和载体被同一限制性核酸

6、内切酶(EcoRI )消化酶切断后，两者两端有相同的粘性末端，被称为单一酶切断点的粘性末端，全相粘性末端高的背景载体被单一限制核酸内切酶切断后，载体分子容易自循环目的对基因的重组不利，可以大幅度降低阳性克隆的效率，为非重组载体提供高背景。 为了防止载体的自环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5p，以抑制DNA的自环化。 连接反应中，具有5-P的目的基因DNA片段可以通过粘性末端与脱磷酸化质粒DNA载体互补地连接，尽管产生的重组DNA分子在连接点含有两个缺损的开环分子，但在转化时，尽管转化效率比线性低将用、单一的限制性核酸内切酶(EcoRI等)切断的目的基因和载体双向插入，由于两者的粘性末端

7、相同，通过连接反应，目的基因被双向插入，载体在目的基因的表达上有方向性，目的基因被双向连接， 如果这种连接对克隆目的基因片段没有影响，为了表达，我们必须对插入的片段进行方向鉴定，而目的基因从开始密码子到结束密码子方向表达的是方向转录，因此，启动子和目的基因的编码方向相反时，目的基因的mRNA 构建表达DNA的重组体，用双酶切断目的基因和载体，就可以使目的基因和载体的结合产生定向结合重组，制作定向克隆。 (YL )、第6节重组DNA被导入受体细胞，在基因工程上，目的基因和载体与重组DNA分子结合后，以下重要的工作主要是导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖

8、，即黑由于外源基因和载体组成的重组DNA分子的性质和宿主细胞不同，所以将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不同。 转化DNA被导入宿主细胞，受体细胞：也称为宿主细胞，是指在转化、转化、杂交中接收外来基因的细胞。 原核受体细胞(主要是大肠菌)、真核受体细胞(主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(实际上是真核受体细胞)。 作为具有接受外来DNA能力的限制性酶缺陷型珠粒或DNA重组型珠粒的标记，在有利于与载体对应表达的人体或非培养条件下生存是不适当的，是安全有利的。 受体细胞条件、原核生物细胞是理想的受体细胞：没有细胞壁，容易进入外来DNA； 没有核膜，没有固定结合于染色体DNA的蛋白质，外来DNA和

9、染色体DNA的重组容易，基因组小，遗传背景简单，容易进行外来基因的遗传分析，容易得到一致的实验材料，培养简单，繁殖快，容易重复。 表达真核生物的基因存在一定的缺陷，许多真核生物基因在原核生物细胞中无法表达具有生物活性的功能蛋白。需要适当修改，酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共享的特性外，还具有基因结构比较简单，其基因表达调控机制研究明确，基因工程操作容易等优点，培养简单，适合大规模生产，分泌成本低的表达，使产物的提取和加工变得容易真核生物细胞酵母受体细胞、植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性之外，最突出的优点是其体细胞的全能性，获得外来基因的体细胞能培养出能稳定遗传的株和系统。 缺乏

10、的是植物细胞有与纤维素相关的硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。 动物细胞也作为受体细胞发挥作用。 经常早期采用生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞作为受体细胞，近年来，干细胞成为新的研究热点。 原核生物细胞、大肠菌的优点：结构简单、操作分析简单的缺点：表达蛋白质可能不活性，真核生物细胞、酵母的优点：表达蛋白质加工活性的缺点：操作比较麻烦，大肠菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。 一般采用的是大肠菌的受体细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数增殖的大肠菌，得到高效转化的受体细胞。 有时也用Rb、Mn2、k、矾石、二硫苏糖醇(DTT )和氯化半钴处理生成诱导细胞。 受体细胞吸收外来DNA分子，

11、有效地成为转化受体的生理状态。 一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。 1、直接导入法：(1)显微注射法：使用显微注射器在显微镜下将目的基因直接注入宿主细胞。 (2)电击法：用电击计的高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 (3)直接吸收法：将目的基因和宿主细胞混合吸收。 (4)基因枪法：在金属微粒上涂上目标基因，向宿主细胞发射。 基因导入方法，一般是用微移液管吸取施主DNA溶液，在显微镜下正确地插入受体核，注入DNA。 这个法律经常用于转基因动物的基因转移。 (1)微注射技术：将外来基因直接注射到真核细胞内的方法将外来基因通过毛细血管用显微镜注释到受精卵的核的方法。 (2)电转换法也被称为高压电穿

12、孔法(简称电穿孔法)，即向受体细胞暂时施加高压电流脉冲，在质膜上形成纳米尺寸的细孔，DNA直接通过这些细孔，或作为细孔封闭时产生的膜成分再分布并进入细胞质。 该方法可用于真核细胞(动物细胞、植物细胞等)和原核细胞(大肠菌、其他细菌等)的外来DNA的直接导入。 穿孔法具有简便、快速、效率高等优点，电击处理方式对转化率有决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是低电压，处理时间长(350V/cm 54s )。 另一种是高电压、短时间处理(11.25kV/cm、10s )。 一般常用的第二处理方式。 1、采用磷酸钙沉淀法、磷酸钙-DNA共沉淀法，将外源基因和噬菌体DNA重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物

13、细胞，简称磷酸钙沉淀法。 细胞有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，大部分双链DNA可以通过这种方法导入细胞，并且细胞吞噬DNA磷酸钙复合粒子，用电子显微镜可以看得很清楚。 该方法的转染效率远远不如体外包装法。 (3)直接吸收法： Ca2诱导DNA转化成大肠菌细胞的可能性： 0的Cacl2低渗透溶液使细菌细胞膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层成为液晶结构，解离细胞外膜和内膜间隙的一部分核酸酶，诱导大肠菌的接受状态。Ca2与添加的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase )的羟基磷酸钙复合体，附着在细菌细胞膜的外表面。 42热刺激暂时处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈紊乱，同时出现许多间隙

14、，为DNA分子提供了进入细胞的通路。 这个方法重现性好。 操作简单快捷，适合诱导细胞的批量制备。 通过转化该受体细胞，每质粒DNA1g可获得51062l07个转化菌落，完全满足质粒的正常克隆需要，Mg2对DNA分子有很大的稳定性作用，因此用Mgcl2和Cacl2处理大肠杆菌细胞利用二甲基亚砜(DMSO )和二硫苏糖醇(DDT )等进一步处理细胞，就能诱导高频诱导细胞的形成，转化效率提高到1001，000万倍，而且能对大小的质粒分子进行有效的转化。 但是，该法律条件高，对外部污染物极其敏感，通常很少被采用。 (4)基因枪技术，也被称为高速微子弹射击法、微子弹射击法、高速粒子撞击法的基本原理：在微

15、子弹(1m )的表面吸附DNA，用放电或机械加速，将子弹进入完整的细胞或组织。 基本方法：将外来DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5m )一起保温，使DNA吸附在金属粒子表面，通过放电使金属粒子加速，以400m/s的速度直接喷射到受体细胞上，外来遗传物质与金属粒子一起进入细胞内部。基因枪转换的操作程序、目标细胞和组织的预处理、微粒子弹的制备、基因枪的装备、冲击、过渡培养、筛选培养和直接分化再生株，PDS-1000 | He System，无宿主限制：农杆菌介导法对双胞胎叶植物敏感，限制了其应用范围。 基因枪没有物种限制。 目标受体种类广泛：原生质体、叶、浮游细胞、茎和根的切断、种子胚、

16、愈伤组织、花粉等。 操作简单快捷，基因枪法转换的优点是：便携式基因枪，1 .体外包装转染法，又称为感染，将目标基因载在载体上，感染表达的细胞，在宿主菌体内放大和表达外源基因。 常用的载体是质粒、噬菌体和核质粒。 2、间接导入法、2 .脂质体媒介法、在体内或体外运送脂质体(也称人工膜胞)的方法，一般需要将DNA或RNA封装在脂质体内，进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。 该方法具有以下多方面的优点：在导入细胞前保护DNA不受核酸酶的分解作用的影响，降低对细胞的毒性效果，适用植物种类广泛，重现性高，包装在脂质体中的DNA可以稳定地储藏等。 在双胞胎叶子的植物中早发现了多发生在法国、东欧、意大利的葡萄和果树上的冠痹瘤病。 1907年Smith和Townsent等人首先发现这种冠心病是由根癌农杆菌引起的。 3、农杆菌的Ti质粒和植物遗传转化、Tumor induced by A. tumefaciens、农杆菌媒介法转基因的基本流程、生理状态、来源、植物愈伤组织的诱导、农杆菌的活化、愈伤组