线粒体疾病的分子生物学检验

1、线粒体疾病的分子生物学检查，分子线粒体疾病，2，线粒体，1。真核细胞中的细胞器以二元裂变方式代谢，平均寿命为10天。大多数细胞含有几个到几千个线粒体。每个线粒体包含2-10个线粒体DNA，3个。线粒体功能，和MITT 120:634648、三磷酸腺苷、能量代谢，其他功能，储存钙离子以调节膜电位和控制程序性细胞死亡，细胞增殖和调节细胞代谢，合成胆固醇和一些血红素产热，维基百科，线粒体代谢，发现1962年，卢夫和其他人发现一个年轻的瑞典妇女伴随着异常增加的基础代谢率。直到1988年，华莱士等人首次报道了由线粒体DNA突变引起的人类疾病，并明确指出mtDNA突变可以引起人类疾病。定义它是一组由遗传缺

2、陷、三磷酸腺苷合成障碍和能量来源不足引起的线粒体异常引起的异质性疾病，也称为线粒体细胞病。发病率-约1:5000(每5000人中约有一人)，Smeitink2006，线粒体疾病，一组具有高临床变异性和遗传异质性的疾病，线粒体蛋白，16，569 BP环状双链(MTDNA) 20%，1，500核大分子80%，结构蛋白OxphosplexesProteRequiredForassemblyOxphosplexepProtectivedinmtdntralationproteinInvolvedinmtdnamaintenancepro tein solvendinved华莱士，18171819，寿桥

3、，2001；Schapira，2000，进一步导致线粒体功能异常：底物转运缺陷；底物利用的缺陷；柠檬酸循环异常；氧化磷酸化解耦；异常的呼吸链。发病特点，常染色体隐性、显性或X连锁遗传的核基因突变，母体遗传的线粒体基因突变(突变型mtDNA在母体血液中增加，患病后代的发病频率增加)，以及mtDNA突变与临床表型之间的关系复杂，这主要说明同一mtDNA突变可引起许多不同的疾病表型，而同一疾病表型可由许多不同的mtDNA突变诱发。遗传异质性，婴儿发病更为常见，核基因突变编码线粒体结构蛋白进行性突眼症(PEO)，线粒体神经胃肠病，利氏综合征线粒体蛋白翻译相关核基因突变2004年，米勒等人首次报道了线粒

4、体核糖体蛋白亚基16(MRPS16)核基因编码的纯合突变，导致先天性畸形伴张力衰竭，肢体水肿，肝转氨酶活性增高和乳酸亚基中毒。该女婴，核基因突变，线粒体基因突变，突变效应：氧化磷酸化酶异常阈值效应导致呼吸链功能障碍：mtDNA组织特异性突变可能在复制和分离过程中在母体遗传中分布不均；不同的突变后代有不同的风险。与A8344G突变相比，携带A3243G突变的母体后代更易患病。突变分布：在不同的器官和组织中同质性是相同的，在不同的组织和细胞中异质性是不同的，一般特征，材料特性)，11，同质突变和异质突变，12，线粒体基因同质性是0或100%，异质性是0-100%，核基因纯合性是0或100%，杂合性

5、是50%，mtDNA同质性/异质性突变和阈值，13，线粒体基因突变，点突变已报道了近330种mtDNA点突变，涉及由MTDNA编码的各种基因。其中，结构基因突变177例，tRNA基因突变137例，rRNA基因突变12例，D-环区LHON突变2例，线粒体脑肌病伴乳酸血症综合征和中风发作综合征，肌阵挛性癫痫，断红纤维病，母体遗传性糖尿病伴耳聋综合征等。还有上百种遗传性痉挛性截瘫()。线粒体疾病是复杂的疾病，复杂的遗传，常染色体显性遗传，常染色体显性遗传，性别连锁遗传，母体遗传，复杂的临床表型，涉及多个系统，影响几乎所有的组织和器官。线粒体功能涉及许多组织和

6、器官。线粒体疾病具有共同的临床特征。婴儿发病：在患有环氧化酶阴性肌纤维、脑病和利综合征的婴儿中很常见。儿童发病率：MELAS、MERRF、利氏病、线粒体肌病、线粒体心肌病和KSS。中枢神经系统损伤：周围神经损伤，如共济失调、癫痫、肌张力障碍、脊髓疾病等。交感神经病变发生在MNGIE和Wolfram综合征中；视神经病变发生在Leber病中，显性视神经萎缩1型听力损失发生在KSS肌病、线粒体肌病、MELAS和KSS。眼外肌麻痹在KSS和PEO(高临床变异性)均有发现。Lancet2000，线粒体疾病的生化诊断。当患者的遗传变异无法确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。代谢物分析(血液、尿液、脑脊液等

7、)血液可以正常，但脑脊液更不正常(动脉比静脉好)；乳酸盐/丙酮酸盐比率高(50:1)表明呼吸链被阻断。正常并不排除线粒体疾病。氧化磷酸化系统酶活性的酶测定。(西方，比色法等。)该方法不稳定。正常情况下，血清CK(肌酸激酶)正常或略有升高；在慢性进行性眼外肌麻痹中发现了30%的升高。mtDNA损失非常高。金和力美帝斯，2011年4月；34(2):283-292，19，线粒体疾病的生化诊断，当患者的遗传变异不能确定时，完整的生化检查可以辅助诊断。经肌肉活检证实的线粒体疾病的肌肉病理变化特征：(1)线粒体结构异常、细胞色素阴性肌纤维或断裂的红纤维(RRF)是主要病理变化。(2)上述病变频繁发生。(3

8、)缺乏其他肌肉病变。，金和力美帝斯，2011年4月；34(2):283-292，儿童和成人线粒体疾病的诊断标准，符合线粒体脑肌病综合征的临床表现，如KSS、CPEO、MELAS、MERRF等。多系统原因不明疾病必须在至少三个系统中有临床症状，除先证者外，至少有一个母系家族成员可能患有该疾病，这可能排除其他代谢和非代谢疾病。肌肉活检B骨骼肌中有2%断裂的红肌纤维，主要诊断标准，(Bernieretal，2002)(3，5)，21，C有一种或多种下列呼吸链酶活性受到抑制：50岁以下肌肉活检中的COX。50岁以上肌肉活检中COX阴性肌纤维占5%；任何组织中呼吸链酶的活性为20%；任何细胞系的呼吸链酶

9、活性为30%；两种组织中相同呼吸链酶活性超过30%；主要诊断标准、次要诊断标准、症状与线粒体脑肌病的临床表现一致；以下至少一项提示了肌肉中线粒体的异常表现：30-50岁肌肉活检的RRF值为1%-2%；RRF；出现在30岁以下的肌肉活检中；电镜下观察到广泛的线粒体异常。至少有一种呼吸链功能被抑制：生化或极谱呼吸链复合物活性为200%；免疫法证实呼吸链复合物的表达降低。(Bernieretal，2002)(3，5)，二级诊断标准：C，发现可能相关的mtDNA异常；氧化磷酸化损伤的一种或多种表现：脑脊液或血液中乳酸、丙酮酸和/或丙氨酸增加；如果怀疑KSS，脑脊液蛋白增加；PET或31P-MRS证实肌

10、肉或大脑代谢降低；最大氧分压、平均氧分压或乳酸阈降低。(Bernieretal，2002)(3，5)，那些满足上述两个主要诊断指标或一个主要诊断指标和两个次要诊断指标的人都被确认为线粒体疾病；符合一个主要诊断指标和一个次要诊断指标或至少三个次要诊断指标的人被怀疑是线粒体疾病。那些符合一个主要诊断指标或在符合临床表现的基础上有一个次要诊断指标的人被怀疑是线粒体疾病。，2011年4月。34(2):283-292，在诊断线粒体疾病时，应注意基因诊断和生化检查的结合，如能量代谢、呼吸链和酶复合物活性等。有必要区分由病理突变和正常衰老引起的线粒体基因突变。线粒体基因异常与临床表现的严重程度之间存在剂量-

11、效应关系，分布与遗传之间存在相关性。诊断时有必要排除环境、药物和衰老等因素。第一节线粒体基因组与疾病，线粒体基因组及其表达系统：线粒体基因组与核基因组的关系，线粒体基因组变异与疾病，27，人类线粒体基因组，轻链：8 trna和1 mrna (nd6)重链336014 trna，2 rrna和12 mrnapolystronic，具有转录后加工，具有小基因组，仅16569bp双链环状DNA13结构基因/Mrna 2tRNA基因2rRNA基因12SrRNA基因16SrRNATheheavystrandencodes28genes和Theheavystran

12、dencodes28genes总共有37个基因。其中37个基因，13个重折叠蛋白(多肽)，22个重折叠转运蛋白(tRNA)和两个重折叠转运蛋白(rRNA)。transport chain(13肽)manyofthegensencodetratransport chain :2 Rnasmitochondrialrrnaisencodedbymt-RNR 1(12 rrna)MT-RNR 2(16 srrna)。22 ThErnesthefollowingeneencodterna :ControlregionD-loop，576，Replication，humanmitocondrialdna

13、(mtDNA)hasthreepromoters，H1，H2，andL(heavystrand1，heavystrand2，and light strandpromoters). the1PromoterTranscripttheEntirLightstrend . the2promothercausetheTransportionofthetwmitocondrirrn Amolecules .转录，theprocessoftranscriptioninitiationinmitochondriainvolvethesreetypesofproteins : themetrictohondr

14、ialRnapolymars(PORLMT)，2 .线粒体转录因子A (TFAM)，3。线粒体转录因子Sb1和B2。43，第1节线粒体基因组与疾病，线粒体基因组及其表达系统线粒体基因组与核基因组的关系线粒体基因组变异与疾病，44，核基因组与线粒体基因组的相互作用，核基因组编码1500多种线粒体蛋白质，线粒体基因组仅编码13种多肽链，“串音”机制，45，第1节线粒体基因组与疾病，线粒体基因组与核基因组的关系线粒体基因组变异及其表达系统线粒体基因组变异与疾病线粒体基因组变异碱基突变：其中，结构基因的点突变，如核基因组，包括同义突变和错义突变的缺失和插入：mtDNA拷贝数突变：线粒体基因组变异和疾病

15、耳聋，Leber遗传性视神经病变，糖尿病，高血压，肿瘤，46，线粒体相关疾病中常见的DNA点突变，MELAS综合征(线粒体脑肌病乳酸性酸中毒和卒中样发作):A3243G(80%)，T3271C(在tRNALeu(UUR)基因中)，MERRF(肌阵挛性癫痫伴红色纤维断裂):A8344G(80%)，T8356 C(80%) G3460A (in nd4基因)T1494C (in 12SrRNA基因)A3243G (in tRNALeu(UUR)基因)2型糖尿病3360A 3243G (in tRNALeu(UUR)基因)NARP(共济失调伴视网膜色素变性神经病):T8993G，T8993C(。 样本选择：在头发、唾液、尿液和骨骼肌中检测mtDNA分子诊断的最佳样本，通常用于外周血白细胞、检测已知DNA突变的方法：等位基因特