基因工程及其在食品科学中的应用

1、第二章基因工程及其在食品科学中的应用，第一节基因工程的基础，第一节基因工程的定义，意义和研究内容(第一)基因工程的定义geneengineggenetinernerginenternandateniquemolecularning (第二) 基因工程的最大特征是打破生物种的边界，进行生物种(属、科、眼、纲、门、界)内外的基因重组、遗传信息的转移，是人工改变生物遗传性的根本技术。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症、肥胖症、痴呆症、骨质疏松症；(3)基因工程的研究内容、目的基因的调制、重组DNA的构建、重组DNA的获得、重组DNA的阳性克隆的筛选、目的基因在受体生物细胞中的高效表达； 限制性内切酶

2、DNA甲基化酶、DNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶连接酶激酶磷酸酶(1)限制性内切酶和DNA甲基化酶1， 限制性内切酶的定义：能识别和切断双链DNA分子内的核苷酸序列的内切酶DNA methylase :能识别DNA特定序列的特定碱基的特定位置上导入甲基产生修饰作用的酶2，限制酶的命名和分类(1)限制酶的命名， 参照HOSmith和D.Nathans提出的命名对象酶的供体微生物的属名和物种名结合的原则进行，具体来说，以由属名的开头字符(大写)和物种名的开头两个字符(小写)构成的三个字符符号为基本形式：用Eco将来自大肠菌(Escherichiacoli )的酶来自流行性感冒杆菌的Hin，如

3、果同一种类的两种微生物的物种名称的前两个字符完全相同，则来自后者的微生物的酶的符号，将上述三个字符符号中的最后一个字符，称为Haemophilusparainfluenzae (流感) 替换为来源的Hpa、来源于同一属的Haemophilusparahaemolyticus (溶血菌)的Hph。 微生物具有特殊名称时，将表示该特殊名称的符号放在上述三字符符号之后：用Hind表示来自Haemophilusinfluenzae的Rd株； 来自Haemophilusinfluenzae的Rf型用Hinf表示。 从同一微生物株系分离纯化多种限制酶时，按照分离的顺序，在上述命名符号之后，将来自海马芽孢杆

4、菌的3种酶用HaeI、Hae、Hae表示，来自海马芽孢杆菌的Rd株的3种酶分别为HindI、Hind 为了区别，在上述命名名前加r表示限制酶类，在上述命名名前加m，则来源于半胱氨酸的Rd株的第三种限制内核酸酶为R.Hind，与其对应的DNA甲基化酶为M.Hind。将大鼠生长激素基因移植到小鼠体内，(2)限制酶的分类根据酶的性质，限制酶可分为三种类型：I型：的不同亚基组成的辅助因子为ATP， Mg2和S-腺苷蛋氨酸切断部位距其识别部位至少1000bp，切断作用为随机型：的两个相同亚基组成的辅助因子只有Mg2，该识别部位总是具有旋转对称性，该切断部位与该识别部位重叠，且， 切断作用特异性强的模具：

5、的2种不同的亚基组成辅助因子为ATP和Mg2，也被S-腺苷蛋氨酸活化，但不是必须的其切断部位一般从该识别部位起为3端2426bp， 必须指出PST i5-ctgcagg-33-gackc-5 HPAI5- gtaac-33-cattg-5，限制酶的旋转对称性是I型和型限制酶兼备限制酶活性和甲基化酶活性的型限制内切酶活性型限制核酸酶及其对应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。 (3)型限制内核酸酶的基本特性识别序列和切断部位型限制内核酸酶能够识别长47bp的双链DNA的特定序列，该识别序列(识别部位)总是以旋转对称性切断方式使末端对齐，5磷酸末端的25个核酸突出单链粘性末端， 3-羟基末端

6、的25个核苷酸突出单链粘性末端，型限内切酶切割方式为同裂酶和同尾酶isoschizomer :型限内切酶，来源不同，识别序列和切割方式相同： Hpa和MspI两者的识别序列都是CCGG 虽然两者的识别序列与同裂酶isocaudamer :来源不同，但DNA被切断后，像BamHI、BclI、Bgl、MboI、Sau3AI、Xho等一样，相同的GATC四核苷酸突出单链的粘性末端，因此用同尾酶将DNA 限制片段长度和切断频率被限制内切酶切断后产生的DNA片段称为限制片段(restrictionfragment )。 一般来说，不同限制酶切断DNA后形成的限制片段的长度，若将某DNA分子中a或t出现的

7、频率设为x、g或c出现的频率设为y，则某限制酶在该DNA分子上的切断部位出现的频率(切断频率或部位频率) f， F=XnYm式： n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数m该限制酶识别序列中的双链G=C碱基对的数，构成某一DNA分子的碱基对的总数(b )和某一限制酶识别部位的碱基序列是已知的，该限制酶在DNA分子上的理论切断部位数(n )， 假定N=BF在某个DNA分子中的4种碱基数相等，识别序列为4个碱基对的限制酶在该DNA分子中的切断部位出现的频率为(14)4，即1256个碱基对中出现一个切断部位。 同样，序列为6碱基对的限制酶，其DNA分子中出现切断部位的频率为(14)6，即14096，

8、即平均4096碱基对中出现1切断部位。 实际情况和理论不一致，(4)影响限制性核酸内切酶活性的因素和优化策略基质DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、苯酚、氯仿、乙醇和高浓度盐离子等污染物抑制限制性酶活性。 基质DNA甲基化程度：大肠杆菌的大部分菌株含有a、dam甲基化酶两种DNA甲基化酶，b、dcm甲基化酶。 基质DNA的结构配置：环状双螺旋DNA比线性DNA稳定。 因此，用限制酶分解相同分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需要的酶量是线性DNA的1020倍。酶反应缓冲液的组成：酶反应的最佳温度：为了提高限制底物DNA对低纯度制备物的酶反应的效率，a一般增加限制酶的使用量(平均每底物

9、dnag可以使用10IU以上)。 延长b酶催化反应的保温时间，扩大使酶分解更完全的c酶催化反应体积，稀释潜在的抑制因子，在减弱抑制作用的d反应液中加入适量的亚氨基二胺(一般应用浓度为12.5mmolL )，限制酶对基因组DNA的酶分解作用。 (2)DNA聚合酶最常用的DNA依赖DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I (全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌体DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 也就是说，逆转录酶也可以优先以RNA为模板，以DNA为模板，因此该聚合酶以RNA为模板，来自双链DNA、1、大肠菌DNA聚合酶I (全酶) :大肠菌； 分子量：

10、 109103的多肽链(1)作用具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以具有3自由羟基的DNA片段为引物，外接53核酸酶活性，从5端开始双链DNA也分解，RNA-DNA杂交体中的r 35外接核酸酶活性，基质是具有3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 (2)主要用途是用尼克翻译法标记DNA。 在所有的聚合酶中，能够利用这种反应的只有这种酶，具有53个外接核酸酶活性。 在DNA分子的三个突出尾上做末端标记。 DNA聚合酶，2，来自大肠菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段) :大肠菌DNA聚合酶I全酶被枯草菌蛋白酶分解，也可以用克隆技术获得。 分子量： 76103的多肽链(1)作用为53

11、DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以具有3自由羟基的DNA片段为引物的35外接核酸酶活性，基质为具有3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 (2)如果用主要用途的补充限制酶切断双链DNA而产生的3个凹端标记的dNTP来补充双链DNA的3个凹端，则能够末端标记DNA分子的3个突出尾端的cDNA克隆中，合成cDNA的第二链的Sanger双脱氧链末端终止法Klenow酶的作用方式，来源于3，T4噬菌体DNA聚合酶： T4噬菌体感染大肠菌分子量： 114103(1)作用53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模型，以具有3自由羟基的DNA片段为引物的35外切核酸酶活性， 底物是具有3自由羟基的双链DNA

12、或单链DNA (2)主要的用途是，用互补标记的dNTP来补充双链DNA的3个凹端，就可以末端标记DNA分子的3个尾，该酶可以末端标记DNA分子此特性经常用于制造与合成接头连接的双链DNA。 4、TaqDNA聚合酶的来源：水生菌是一种非常耐热的DNA相关DNA聚合酶，能在基因工程中生产分子量： 65103。 (1)作用具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以具有3自由羟基的DNA片段为引物。 (2)主要用途是通过确定DNA序列的聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR )体外扩增DNA分子的特定序列。 5、来源于逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶) :鸟髓细

13、胞瘤病毒(AMV )，分子量170103； 是一种表达克隆的Moloney小鼠白血病病毒(Mo-MLV )逆转录酶基因的大肠杆菌，分子量为84103。 (1)作用(2)主要用途6，来源于末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶) :犊牛胸腺分子量： 60103(1)作用(2)主要用途，(3)来源于依赖DNA的RNA聚合酶1，SP6噬菌体RNA聚合酶： SP6噬菌体感染噬菌体(1)作用该酶主要具有53RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上对应的噬菌体特异性启动子，并以该双链DNA为模板合成RNA。(2)主要用途合成单链RNA，制备杂交瘤的合成单链RNA成为体外翻译系统中功能性mRNA或体外剪切反应的基质

14、。 来自2、T7或T3噬菌体RNA聚合酶： T7或T3噬菌体感染大肠杆菌。 (1)该酶的作用主要是53RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上对应的噬菌体特异性启动子，以该双链DNA为模板合成RNA。 (2)在主要用途中合成单链RNA，调制杂交瘤利用具有T7噬菌体启动子的载体，将单链RNA合成为体外翻译系统中功能性mRNA或体外剪切反应的基质，用大肠菌和酵母表达克隆基因。 (4)连接酶、激酶和磷酸酶DNA连接酶(DNA ligase ) :连接两个DNA的酶类。 基因工程中最常见的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶。 RNA连接酶(RNA ligase ) :使包含5磷酸基末端和3羟基末端的单

15、链RNA (或DNA )共价键合。 该酶主要用于向RNA的三羟基末端加入RNA的三端标记，即32P标记的三，五二磷酸单核苷(pNp )。 1，T4噬菌体DNA连接酶来源： T4噬菌体感染的大肠杆菌分子量： 68103(1)作用此酶主要具有一种活性，在催化DNA的5磷酸基和3羟基之间形成磷酸二酯键。 该酶的核酸基质是粘性末端DNA、平坦末端DNA、切割的DNA等。 (2)主要用途连接带符合粘性末端的DNA分子。 使平坦末端的双链DNA分子相互结合，或与合成接头结合。 这种反应比粘性末端键慢得多。 2，T4噬菌体多核苷酸激酶的来源： T4噬菌体感染的大肠杆菌(1)作用具有激酶氧化活性，催化ATP的

16、磷酸基具有向DNA或RNA的5末端转移的3磷酸酶活性，该酶的核酸基质为双链DNA，单链(为了Maxam-Gilbert法定序、S1核酸酶分析和其他必须使用末端标记DNA的操作，在主要用途中为标记DNA的5个端点的连接准备了，但缺乏5磷酸的DNA和合成接头被磷酸化。 3、碱性磷酸酶来源：来自大肠菌和牛小肠(1)作用两种碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶(bacteralalkalinephalosphatase，BAP )和牛小肠碱性磷酸酶(calf 该酶的基质是单链或双链DNA和RNA，rNTP和dNTP。 (2)主要用途是，在用32P标记5末端前，去除DNA或RNA分子的5磷酸和去除DNA片段5磷酸，防止自环化。 (五)核酸酶1、BAL31核酸酶源：埃希莉娅奥塔纳兹纳(Alteromonasespejiana)BAL31。 (1)作用(2)主要用途2，S1核酸酶来源：曲霉(Aspergillusoryzae)(1)作用(2)主要用途，3，核酸酶A(RNA酶a )来源：牛胰脏(1)作用该酶主要是一种活性，即内核酸在低盐浓度下，可