遗传病的诊断课件

1、第十二章 遗传病的诊断,普遍性及特殊性 产前诊断 (prenatal diagnosis) 症状前诊断 (presymptomatic diagnosis) 现症病人诊断 (symptomatic diagnosis),第一节 病史、症状和体征 病史: 家族聚集现象 准确、详尽 家族史 生育史 婚姻史 2.症状和体征,第二节 系谱分析 绘制系谱能准确而有效地记录家族史，对遗传病的诊断及确定遗传病的遗传方式是非常重要的。系谱以图解的方式提供各种信息，易于分析和解释。 系谱分析是在对先证者的症状、体征、实验室检查和其他辅助检查作出诊断之后，进一步追溯家系中其他成员，绘出系谱图。 在系谱绘制过程中要

2、力求 系统、完整、真实、 去伪存真 注意有新的基因突变 辨别遗传方式,一、孟德尔式遗传病 遗传异质性 延迟显性 二、非孟德尔式遗传病 1.线粒体遗传病 线粒体遗传病的特点:母系遗传,主要表现为晚发，并呈进行性加重。 2.多基因病 (多因子疾病、复杂性疾病) 三、具有特殊遗传方式的疾病 遗传印记 动态突变,第三节 细胞遗传学检查 一、染色体检查 染色体检查适应指征： 智能发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸形者：原发闭经、男女不孕症者、两性内外生殖器畸形者。 夫妇中有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等。 多发性流产的妇女及其丈夫。 家族中己发现染色体异常或先天畸形个体。 34岁以上的高龄孕妇。 二、

3、性染色质检查 X染色质检查 X染色质的检查可刮取口腔粘膜、阴道粘膜脱落上皮细胞，亦可采用绒毛或羊水中胎儿脱落细胞涂片，经硫堇或甲苯胺蓝染色，在光镜下计数X染色质数目。如Turner综合征X染色质为阴性，Klinefelter综合征X染色质为阳性。 Y染色质检查 Y染色质检查适用于具有一个或一个以上Y染色体的个体或细胞群 。如XYY男性有2个Y小体。,整条染色体涂染,三、染色体荧光原位杂交,易位染色体,第四节 生物化学检查 检测酶的缺陷和代谢中间产物 血和尿液 滤纸片和利用显色反应进行检测。例如:苯丙酮尿症患者的尿呈绿色 ，尿黑酸尿症患者的尿则呈深棕色。,细菌抑制实验（Guthrie),10mg

4、/dl 2mg/dl,第五节 基因诊断 基因诊断就是利用DNA重组技术直接从DNA水平上检测人类遗传性疾病的基因缺陷，因此这种诊断方法又称为DNA分析法。 常用基因诊断的技术： 分子杂交 聚合酶链反应 (PCR) 聚合酶链反应-单链构象多态 (PCR-SSCP) RFLP分析,基因诊断,直接诊断,间接诊断,限制性内切酶片段长度多态性(RFLP),聚合酶链反应（PCR）,分子杂交：点印迹 (dot blot) 斑点杂交(dot and slot hybridization) 等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO ) Southern印迹法(Southern blot) Northern印迹法(No

5、rthern blot) Western印迹法(Western blot),多态性连锁分析（RFLP) 变性梯度凝胶电泳（DGGE) 单链构象多态性分析（SSCP） DNA芯片(DNA chip),基因诊断的一般方法,Southern印迹法(直接分子杂交法）,（1）制备样品： 提取DNA或RNA 限制性内切酶消化 凝胶电泳 变性处理 转印到支持膜 （2）制备探针 （3）杂交 （4）检测,HbS 镰型细胞贫血 CCTGTGGAG,正常人Mst II,1.15kb,0.2kb,异常,1.35kb,Southern,AA AS SS,RFLP法（间接分子杂交连锁分析法）,9.7kb 与PKU连锁，可

6、以进行明确产前诊断,诊断苯丙酮尿症,RFLP 连锁分析检测成年型多囊病APKD,AD, 1/1000 ,30岁后，肾、肝多发性囊肿：腰痛、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂肾炎、肾结石等，导致肾功能衰竭和尿毒症。 发病机理未明。 APKD 致病基因与珠蛋白基因3附近的一段小卫星DNA 序列HVR紧密连锁。,5.7kb 3.4kb 2.4kb,12.5kb,7.7kb,16.5kb,7.7kb,正常人,右侧缺失,左侧缺失,RFLP诊断 地中海贫血 用限制性核酸内切酶Bgl II消化,产妇陈某某，34岁，广东籍，第3胎。第1胎流产，第2胎足月分娩一女婴，患HbH病;丈夫患a地中海贫血1，孕妇本人患a地中海

7、贫血2。妊娠17周左右，用羊膜穿刺术取羊水20ml，并取孕妇及其丈夫、女儿抗凝静脉血各l0ml，制备染色体DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离，通过DNA印迹法转移至硝酸纤维素膜上，与P标记的基因探针进行分子杂交，放射自显影结果如图所示。,？,1 2,3 4 5,1 2 4 5,16.5kb 12.5kb,7.7kb,aa/a- aa/- a-/- aa/aa,遗传标记,1、第一代遗传标记限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),8kb,5kb,3kb,在个体和群体中，片段长度表现出多态性。 如3kb, 5kb, 7kb,

8、 8kb RFLP呈现孟德尔式遗传。 常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。,产生多态性的原因是内切酶位点的变化。 原位点的消失；新位点的产生。,GAATTC CTTAAG,GATTTC CTAAAG,2kb,3kb,5kb,7kb,2、第二代遗传标记微卫星DNA(Micro-satellite DNA) 属高度重复序列，重复单元26bp，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。,TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCG

9、TCGTCGTCTCGAACG,常用检查方法：PCR等。,微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：,500bp 400bp 300bp 240bp,该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。,2、第三代遗传标记单核苷酸多态性(SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如：,个体A 个体B 个体C,SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。 在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个SNP,斑点杂交法 等位基因特异性寡核苷

10、酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO ）,基因的突变部位和性质已完全明了 等位基因特异的寡核苷酸探针 探针通常为长20bp左右的核苷酸 正常探针：与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交； 突变探针：与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交 PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。,异常探针 T A G,正常人 患者 DNA DNA,点杂交,正常探针 G

11、 A G,正常人 患者 DNA DNA,点杂交,HbS,PKU,二、聚合酶链反应技术,预变性(92-95C,2-5m),变性(92-95C,30s),复性 (40-60C,30s),延伸 (72C,30-60s),总延伸 (72C,7m),(25-35),PCR的一般过程：,经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。,我国地中海贫血的发病由位于第16号染色体上的珠蛋白基因簇的3种大片段的缺失所致(分别缺失20000,3700,4200),另有2种点突变只占很少一部分。在缺失断点两侧设计3个引物,可直接检出缺失并区分杂合子与纯合子,4200 3700 20000,13 12 11.2 11.1 11.1 11.2 21 22.1 22.2 22.3,运用扩增21号染色体上6个短串联重复序列()位点及技术,可作产前筛查并诊断该病。,正常 三体 单体,多重等位片段特异性扩增PCR技术 尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。 DMD基因缺失的多重PCR诊断,1 2 3,Exon,3 50 47 52,410bp 270bp