《食品微生物检验技术》课件-项目二 微生物操作技术

1.微生物的分离纯化目录/Contents01菌种分离与纯化技术简介物理消毒灭菌法稀释涂布平板法0203平板划线分离法菌种分离与纯化技术简介

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化,微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落,通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。01菌种分离与纯化技术简介贴标签：打开平皿包扎纸，在平皿上盖边缘贴好标签纸或者用记号笔注明菌种、接种时间、操作者等信息。11bcda制备平板倒平皿：左手持平皿，开口位置过火，右手持三角瓶，向平皿内倾注15-20mL培养基。取三角瓶：在酒精灯无菌区用右手将棉塞拧松，用右手手掌和小拇指拔取棉塞，右手持三角瓶，瓶口保持在酒精灯火焰旁。凝固：倒好的平皿轻轻晃动一下，置于水平操作台上凝固，凝固中不能移动。02稀释涂布平板法取6支盛有9mL无菌水的试管排列于试管架上，依次标上10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6字样。以1ml无菌吸管按无菌操作从样品管中吸取1mL菌液于10-1试管中，然后用另一吸管在10-1试管中来回吹吸三次，使其混合均匀，制成10-1稀释液。再用此吸管从10-1管中吸取1mL稀释液注入10-2管中，依次制成10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释液。梯度稀释02稀释涂布平板法接种：用一支1mL无菌吸管从高稀释度开始分别吸取各个低度稀释液0.1mL至相应的无菌平皿内。11bcda接种涂布涂布：左手少许打开皿盖，用涂布棒把培养基上的菌悬液均匀涂布开。将涂抹好的平板放于操作台上20-30min，使菌液渗入培养基内。烧涂布棒：右手拿涂布棒，在酒精灯上灼烧并冷却。涂布棒灭菌：灼烧涂布棒灭菌。02稀释涂布平板法培养b.清理台面：整理试验台面，实验器具灭菌、清洗归位。a.培养：将接种好的平皿按照微生物最佳培养温度倒置放于恒温培养箱中进行培养。02稀释涂布平板法挑取单菌落02稀释涂布平板法将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述3种培养基斜面上,分别置于28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。贴标签：打开平皿包扎纸，在平皿上盖边缘贴好标签纸或者用记号笔注明菌种、接种时间、操作者等信息。11bcda制备平板倒平皿：左手持平皿，开口位置过火，右手持三角瓶，向平皿内倾注15-20mL培养基。取三角瓶：在酒精灯无菌区用右手将棉塞拧松，用右手手掌和小拇指拔取棉塞，右手持三角瓶，瓶口保持在酒精灯火焰旁。凝固：倒好的平皿轻轻晃动一下，置于水平操作台上凝固，凝固中不能移动。02平板划线分离法取菌：用右手的小指和手掌取下管塞，试管口缓缓过火灭菌2-3次，接种环伸入试管，先使环接触管内壁，冷却。将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。将试管口通过火焰，并塞上棉塞。cb接种环灭菌：右手拿接种环，在火焰上将环端灼烧灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复灼烧2-3次。a准备菌悬液：将菌悬液试管摇匀，拧松试管棉塞。平板划线03平板划线分离法e接种环灭菌：在酒精灯火焰上再次灼烧接种环灭菌。d平板划线：左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌液的接种环迅速伸入平板内，进行连续或分区划线，盖上皿盖。平板划线03平板划线分离法图4-15平板划线法示意图培养b.清理台面：整理试验台面，实验器具灭菌、清洗归位。a.培养：将接种好的平皿按照微生物最佳培养温度倒置放于电热恒温培养箱中进行培养。03平板划线分离法挑取单菌落03平板划线分离法将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述3种培养基斜面上,分别置于28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2.微生物菌种保藏技术目录/Contents01常规保藏方法菌种保藏方法真空冷冻干燥保藏方法0201常规保藏方法

1、菌种保藏的目的存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。01常规保藏方法

1.斜面保藏法

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2～4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。

此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易变异、易被污染。01常规保藏方法2.液体石蜡保藏法

将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1～2年，普通细菌也可保藏1年左右。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种，还可防止干燥，缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。01常规保藏方法处理液体石蜡：将液体石蜡分装于二角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，接着检查是否彻底无菌，即接入肉汤中检查有无杂菌生长。然后放在40℃温箱中，使水分蒸发掉，备用。加石蜡油：用灭菌吸管在无菌操作下将5mL石蜡油注入到已长好菌的斜面上，加入的量以超过斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。保藏：石蜡油封存后，将试管直立，放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。01常规保藏方法

穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年以上不发生明显变异。02沙土保藏方法沙土保藏法①制作沙土管

②灭菌加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。③制备菌液取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中,用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。④加样用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管,再用接种环拌匀。⑤干燥把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气,使之干燥。⑥保藏干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。02真空冷冻干燥保藏方法真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存5年以上，有的可保藏15年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种用得最为广泛的菌种保藏方法。

02真空冷冻干燥保藏方法操作流程准备安瓶管准备脱脂乳准备菌种制备菌悬液分装样品冷冻真空干燥封管存活性检测保藏活化02真空冷冻干燥保藏方法（1）准备安瓿管

用于冷冻干燥菌种保藏的管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，也称泪滴形管。安瓶管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。将标签放入安瓿管内，管口塞上棉花，121℃灭菌30min，备用。02真空冷冻干燥保藏方法（2）制备脱脂乳用鲜乳经处理或使用脱脂乳粉配兑脱脂牛乳，灭菌，并做无菌试验后备用。（3）准备菌种

所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24～48h的培养物；酵母需培养3天；放线菌与丝状真菌则培养7～10天。02真空冷冻干燥保藏方法（4）制备菌悬液

将脱脂牛乳2mL左右直接加到待保藏的菌种斜面试管中，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛乳内成悬浮液。（5）分装样品

用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓶管底部，每支安瓶管的装量约为0.9mL（一般装入量为安瓶管球部体积的1/3）。

（6）冷冻将分装好的安瓶管放在低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓶管插入冷冻剂，只需冷冻4～5min，即可使悬液结冰。02真空冷冻干燥保藏方法（7）真空干燥（8）封管（9）存活性检测抽取一管进行存活性检查。（10）保藏一般4℃冰箱，避光处保藏。（11）活化

如果要从中取出菌种恢复培养，可先用消毒，然后将安瓶管上部在火焰上烧热，再滴几滴无菌水75％酒精将管的外壁，使管子破裂。再用接种针直接挑取松散的干燥样品，在斜面接种。3.微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数技术目录/Contents01微生物细胞大小测定所用器材02微生物菌体大小测定方法微生物检验室01测定用器材微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，只有在显微镜下用刻有一定刻度的测微尺才能测量。目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央刻有精确的刻度，通常是将5mm等分为50小格（或把10mm长度等分为100小格），实际每格等于100μm。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺来标定，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。01测定用器材镜台测微尺镜台测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有精确的刻度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm（即0.01mm)，是专门用来标定目镜测微尺的。01测定用器材镜台测微尺镜台测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有精确的刻度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm（即0.01mm)，是专门用来标定目镜测微尺的。01测定用器材目镜测微尺镜台测微尺01

血球计数板是一块特制的厚型载玻片。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供微生物计数用。这一大方格的长和宽各为1mm，面积为1mm，深度为0.1mm（即盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm），所以其体积为0.1mm。测定用器材血球计数板的构造01测定用器材01测定用器材01血球计数板的构造测定用器材01血球计数板的构造测定用器材02测定方法

目镜测微尺的校正（1）取下接目镜，旋下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度的一面朝下，放入接目镜的隔板上，再旋上目透镜，装入镜筒内。（2）将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央。02测定方法

（3）用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与物镜测微尺的刻度相平行，并使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合；也可使两尺的左边第一条线完全重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线。02测定方法

（4）记录二对重合线间的目镜测微尺所占的格数和镜台测微尺所占的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度

（µm）用同样法，分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。注意：校正目镜测微尺只能在特定的情况下重复使用，若更换物镜或目镜的放大倍数时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。＝两个刻度重合间镜台测微尺格数×10两个刻度重合间目镜测微尺格数02测定方法

菌体大小的测定①将啤酒酵母制成水浸片。②大小换算。将标本先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度,刻度乘上目镜测微尺每格和长度,即等于该微生物的大小。③求平均值

一般测量微生物细胞的大小,用同一放大倍数在同一标本上任意测定10～20个菌体后,求出其平均值即可代表该菌的大小。02测定方法血球计数板的使用

①稀释菌液

根据待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释，目的是便于酵母菌悬液的计数，以每小方格内含有4～5个酵母细胞为宜，一般稀释100倍即可。

②准备计数板取清洁干燥的血球计数板（使用前可通过显微镜检验计数板上有无污物，若有，则需清洗后才能进行计数），在中央的计数室上加盖专用的盖玻片。02测定方法

③加样悬液摇匀，用滴管吸取一滴置于盖玻片的边缘（不宜过多），让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用缓缓渗入计数室，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。

④计数静置片刻（一般5～10min)，使酵母菌全部沉降到血球计数室内。将血球计数板置于载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室后，再换成高倍镜观察并计数。由于活细胞的折射率和水的折射率相近，观察时应减弱光照的强度。02测定