细胞工程：第5章 人源性单克隆抗体的制备

5.2人源性单克隆抗体的制备多克隆抗体鼠源单克隆抗体人-鼠嵌合抗体人源化抗体全人源抗体鼠源单抗临床应用的障碍血清半衰期短，20h抗原抗体结合力、亲和力不够募集效应细胞产生副作用HAMA反应：8－10天出现，20－30天高峰,加速单抗清除。过敏休克HAMA反应

HumanAnti-MouseAntibodies

鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体，叫做人抗鼠抗体（HAMA）反应。HAMA反应对鼠源的单抗分子有着较强的破坏作用，严重影响了鼠源单抗在人体内的功效，所以非常有必要改进鼠源单抗。

抗体研究的世代第一代多克隆抗体第二代单克隆抗体第三代基因工程抗体抗体的结构及其多样性轻链重链免疫球蛋白的基本结构四条链对称结构互补决定区complementaritydeterminingregions(CDR)小鼠抗体嵌合抗体重构抗体人源抗体5.2人源性单克隆抗体的制备5.2.1EB病毒转化技术5.2.2细胞工程单克隆抗体技术1人-鼠杂交瘤单克隆抗体2人-人杂交瘤单克隆抗体3EB病毒转化-融合技术4转基因动物制备单克隆抗体5重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体5.2.3人单抗制备技术的发展（新基因工程技术）5.2.1EB病毒转化技术EB病毒（epstein-barr

virus,EBv）是epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。EB病毒的形态与其他疱疹病毒相似。EB病毒仅能在B淋巴细胞中增殖，可使其转化，能长期传代。

EB病毒转化淋巴细胞5.2.2细胞工程单克隆抗体技术

1人-鼠杂交瘤单克隆抗体

人脾细胞＋鼠骨髓瘤细胞5.2.2细胞工程单克隆抗体技术

2人-人杂交瘤单克隆抗体人脾细胞＋人骨髓瘤细胞细胞种类少5.2.2细胞工程单克隆抗体技术

3EB病毒转化-融合技术利用EB病毒转化B淋巴细胞为永生细胞与鼠骨髓瘤细胞融合5.2.2细胞工程单克隆抗体技术

4转基因动物制备单克隆抗体人抗体基因(除CDR)导入小鼠胚胎转基因小鼠抗原免疫转入人的Ig基因组免疫动物人抗体基因敲除小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体5.2.2细胞工程单克隆抗体技术

5重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体SCID:severecombinedimmunodeficiencymouse既无有功能的T细胞也无B细胞的小鼠,对异源移植物不产生任何排斥反应,可以作为良好的载体系统用于医学及生物学各个领域的研究,但极易感染病菌,饲养和操作管理十分复杂。SCIDSCID:SevereCombinedImmunodeficiency

1)TumorsfromotherspeciesareeasilytransplantedintoSCIDmiceandwillgrowwithoutbeingrejected.2)

SCIDmiceareevenmoreimmunodeficientthannudemice.3)SCIDmiceareidealforthegrowthofhybridomas

invivotoproduceacontinuoussupplyofantibody.

重症联合免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体将人淋巴细胞移植到小鼠体内抗原免疫标准杂交瘤方法或制备抗体库裸鼠T淋巴细胞功能缺陷1962年偶然发现有个别无毛小鼠，后来证实是由于基因突变造成的并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠(nudemice)，用“nu”表示裸基因符号。裸小鼠是由于染色体上等位基因(第11对染色体上)突变引起的，已失去正常胸腺。特性裸小鼠的主要特征表现为无毛(hairless)和无胸腺(athymus)。随着鼠龄增加皮肤变薄、头颈部皮皱褶、发育迟缓。由于无胸腺,仅有胸腺残迹或异常上皮,这种上皮不能使T细胞正常分化，缺乏成熟T细胞的辅助、抑制及杀伤功能，因而细胞免疫力低下。裸小鼠B淋巴细胞正常，但功能欠正常繁殖裸鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，因而饲养和繁殖要求条件比较严格，在SPF（无特定病原(SpecificPathogenFree)）环境下可生存，所用的笼具、垫料、饲料、饮水等都要求经过严密灭菌消毒并采用隔离器饲养，以保证长期存活并进行繁殖。由于纯合型雌裸小鼠nu/nu受孕率低，乳腺发育不良且有食仔的习惯，因此生产上一般采用纯合型雄鼠与杂合型雌鼠交配(♂nu/nu×♀nu/＋)可获1/2纯合型仔代。饲养5.2.3人单抗制备技术的发展

（基因工程）人-鼠嵌合抗体改型抗体组合抗体库技术与噬菌体抗体文库技术表位印模选择技术基因工程抗体

Geneticengineeringantibody概念：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。人-鼠嵌合抗体

chimeric

antibody

改型抗体reshaping

antibody

：

鼠单抗可变区的人源化（CDR移植）

组合抗体库技术（抗体基因文库）

采用RT-PCR技术从淋巴细胞克隆出全套抗体轻链基因和重链基因，将二者分别组建到表达载体中，得到轻链基因库和重链基因Fd

段基因库，再通过DNA重组技术将轻链基因和Fd

随机重组于一个表达载体中，即形成抗体库。1989年底，采用PCR方法克隆机体全部的抗体基因，并重组于原核表达载体中，以标记抗原即可筛选到相应抗体，当时称为组合抗体库技术。组合抗体库出现不到一年即被噬菌体展示抗体库所取代

人淋巴细胞抗原筛选产生特异克隆

RT-PCR

轻链重链基因转印至NC膜

DNA重组组合抗体库E.coli随机表达组合抗体库噬菌体抗体库技术1.噬菌体显示：指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心DNA中含有该蛋白的基因。2.噬菌体抗体：将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达在噬菌体表面，形成噬菌体抗体，将全套抗体可变区基因，组装到表达载体，其抗体表达到噬菌体表面，得到噬菌体抗体。

噬菌体抗体文库技术

噬菌体展示技术

Winter等在1994创建了噬菌体抗体库（repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技术,或称噬菌体抗体技术（Phagedisplay），克服了人体不能随意免疫的缺点，而且不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体。

噬菌体抗体文库

噬菌体表达小分子抗体建立噬菌体抗体库

固相化抗原吸附洗脱扩增噬菌体抗体库小结人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。5.3单克隆抗体在医学上的应用（一）用作诊断试剂

1.检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。

2.鉴定病原体，准确诊断传染病。

3.用于肿瘤的诊断和分型。

4.激素类单抗用于测定体内激素含量，判断内分泌的功能状态。

（二）用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能（三）用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗生物导弹生物导弹单克隆抗具体有高度专一性，能够识别细胞表面抗原、各种受体、各种体液成分及细胞内和组织内的各种成分，能精确地瞄准和捕获靶目标，特异性地与靶目标发生反应。

“生物导弹”——单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。Newapproaches:There'shopeforthefuture.

抗体治疗的机制阻断和中和作用Fc的免疫效应机制信号传导和细胞凋亡免疫调节靶向抑制肿瘤的生长单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性

由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗