DB12-T1271-2023-有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法-天津市

ICS65.080CCSB1012天津市地方标准DB12/T1271—2023有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethod天津市市场监督管理委员会发布DB12/T1271—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测所。本文件主要起草人：张蕾、田雪力、池晶晶、路超、杨春蕾、韩静、王丽丽、白朋勋。IDB12/T1271—2023有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法1范围本文件规定了有机肥中活性大肠杆菌PMA-qPCR测定方法的试剂与引物、主要仪器设备、样品采集、检测步骤和检测结果等技术内容。本文件适用于有机肥中活性大肠杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T525有机肥料3liveEscherichiacoli在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致病菌。光反应4缩略语51DB12/T1271—2023PMA是光敏DNA染料，可与DNA发生不可逆的共价交联反应。PMA无法透过活性细菌完整的细胞膜，但可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中未与核酸交联的剩余PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的DNA进行修饰，不影响DNA正常扩增。样品经PMA预处理后再进行DNA提取及PCR扩增，可以克服常规PCR无法区分活性细菌与死亡细菌释放出的游离DNA的缺陷，有效避免PCR检测中的假阳性结果。6试剂与引物试剂6.16.1.1除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。6.1.2PMA储备液（5μg/μL）：1mgPMA溶于200μL20%的DMSO溶液中，-20℃避光保存。6.1.3PMA工作液：将PMA储备液以20%DMSO溶液稀释10倍。6.1.40.01mol/L（pH7.2）PBS：配方见GB/T19438.1附录A。6.1.595%乙醇。6.1.6DNA提取试剂盒。6.1.7SYBRPremixExTaq染料法实时荧光定量试剂盒：内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg，2+TliRNaseH，SYBRGreenI。根据qPCR仪型号选用ROX或ROXII校正。6.1.8qPCR标准品：含有目的基因的克隆质粒，也可采用经纯化后的基因组DNA。6.2引物大肠杆菌uidA基因qPCR扩增所用引物见表1。表1大肠杆菌uidA基因qPCR扩增引物扩增产物大小167bp7超净工作台、冰箱（0℃～4℃）、分析天平（精度0.01g）、恒温震荡培养箱、LED光解仪（波长465nm～475nm、温度低于37℃）、低温离心机（最大离心力≥12000g）、微型孔板离心机、漩涡震荡器、核酸自动提取仪、qPCR仪、超微量分光光度计等。88.18.28.32DB12/T1271—2023样品在运输过程中宜低温保存，应在6小时内送至实验室进行检测。实验室接样后不能立即检测的，应将样品放入0℃～4℃冰箱保存，放置时间不应超过24h。9检测步骤9.1样品制备将样品进一步缩分后研磨至全部通过Ø1mm尼龙筛，混匀。无菌操作下称取样品10.0g，加入到带玻璃珠的90mL无菌PBS缓冲液中，置于恒温震荡培养箱中，200r/min震荡30min。于4℃，1000×g离心10min收集上清液。9.2PMA处理取1mL上清液至离心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA终浓度约为80μg/mL，避光放置10min。将离心管置于LED光解仪，曝光5min。再将离心管于4℃，12000×g离心5min，弃上清液，无菌PBS缓冲液洗涤2次后重悬。9.3DNA提取可选用等效的商品化核酸提取试剂盒，或选用核酸自动提取仪及配套试剂，参考附录A。9.4qPCR反应9.4.1qPCR反应体系（20μL）：SYBRPremixExTaq10μL，RoxII0.4μL，上下游引物各0.4μL，ddH2O6.8μL，标准品或样品DNA2μL。9.4.2qPCR反应程序：1个循环：50℃，2min，95℃，30s；40个循环：95℃，5s，60℃，34s。9.5提取标准品DNA，根据公式（1）计算出标准品的原始拷贝数。将标准品DNA用ddH2O连续10倍梯度稀释4份～6份，进行qPCR扩增。扩增后，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲…………（1）NA——阿伏伽德罗常数，取6.02×10。2310.1阈值（Ct）设定检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。3DB12/T1271—202310.2质控标准10.2.110.2.2空白对照无Ct值，且无典型扩增曲线。阳性对照的Ct值应＜27.0，并出现典型的扩增曲线。10.3检测结果确定根据样品Ct值，在绘制出的标准曲线图上得到对应的大肠杆菌的DNA量。4DB12/T1271—2023附录A（资料性）DNA自动提取仪操作步骤A.1试剂盒基于磁珠分离技术，均质的样品细胞被裂解，再通过包覆二氧化硅的磁珠来吸附核酸。然后利用清洗液去除杂质，最终由洗脱液将核酸从磁珠上洗脱下来。试剂盒内包含的试剂规格和数量见表A.1。所有试剂应于室温保存（16～30℃），置于阴凉干燥处。使用之前应检查试剂盒有效期，不得使用任何过期试剂。表A.1试剂盒组成试剂名称规格18mL180mL135mL40mL64mL数量单位瓶磁珠液（MagneticBead）裂解液（LysisBuffer）清洗液A（WashingBufferA）清洗液B（WashingBufferB）洗脱液（ElutingBuffer）11221瓶瓶瓶瓶注1：清洗液A在使用前需加135mL95%的乙醇。加完乙醇后要做上标记；注2：清洗液B在使用前需加230mL95%的乙醇。加完乙醇后要做上标记。根据实际工作需要，可选择96孔或48孔萃取样品盘。所有耗材为一次性使用，不得重复使用。5DB12/T1271—2023图A.1萃取样品盘A.4.3启动开启自动核酸萃取仪进样门，安装已加好试剂的96孔萃取样品盘和搅拌套管，确保萃取样品盘完全推入底部。关闭自动核酸萃取仪进样门，按下“开始”按钮。萃取反应将在1小时内完成。A.4.4关闭萃取完成后，取出萃取样品盘，将核酸从6#列/12#列转移到新的离心管保存。最终洗脱下来的核酸可能存在磁珠残留，但并不影响后续操作，若是需最小化磁珠残留所带来的风险，可将洗脱液转移到离心管，全速离心1min，然后将上清液转移到新的离心管中。建议使用新鲜制备的核酸用于后续操作，若要长期保存核酸，建议存于-80℃超低温冰箱。6DB12/T1271—2023参考文献[1]GB/T20000.1—2014标准化工作指南第1部分：标准化和相关活动的通用术语[2]GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法[3]GB19489实验室生物安全通用要求[4]GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法[5]NY525有机肥料[6]GB/T18877-2020有机无机复混肥料[7]马文丽.分子生物学实验手册[M].北京：人民军医出版社,2011.[8]DNA/RNA萃取试剂盒使用手册[9]田雪力.牛粪制卧床垫料过程中物料特征及病原活菌检测方法研究[D].东北农业大学,2019.於颖.PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中食源性致病菌活菌的研究[D].东华大学,2015.盖冬雪,任洪林,卢士英,等.乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立[J].中国畜牧兽[10][11]医,2016,43(2):493-498.[12]于小龙,徐进,张昊,等.PMA-qPCR