细胞工程：实验七 小鼠卵母细胞的采集与形态结构观察

实验七小鼠卵母细胞的采集与形态结构观察一、实验目的初步认识雌性小鼠的生殖器官结构组成及其位置,认识卵巢、输卵管、子宫等生殖器官;掌握小鼠超数排卵的程序及方法;学会输卵管壶腹部采集卵母细胞的方法。初步认识小鼠的卵母细胞的形态结构,掌握采集卵母细胞的基础操作技能。二、实验原理--卵母细胞成熟哺乳动物的卵子发生在卵巢的卵泡内。在卵母细胞成熟发育阶段,初级卵母细胞发生生发泡破裂(germinal

vesicle

breakdown,GVBD)现象,完成第一次成熟分裂(减数分裂,以同源染色体分离为特征),并排出第一极体。一般认为,GVBD的发生和第一极体的排出是卵母细胞核成熟的标志。之后,次级卵母细胞进行第二次成熟分裂(一般为有丝分裂,以染色单体分离为特征),并停滞在第二次成熟分裂中期。在这期间,完成胞质的最后成熟。这时,卵泡发育成熟,将处于第二次成熟分裂中期的卵母细胞连同周围的卵丘细胞随着卵泡液排出。排出的卵母细胞经过输卵管漏斗部进入输卵管,运行到受精部位输卵管膨大部(壶腹部)。卵母细胞只有受精后才完全成熟,完成分裂后期和末期,接着形成一个己受精的合子并放出一个小的第二极体。实验原理–超数排卵为了在一次实验中获得较多数量的卵母细胞,需要用外源性促性腺激素,如孕马血清促性腺素(pregnant

mare

serum

gonadotropin,PMSG)或促卵泡素(follicle

stimulating

hormone,FSH)对实验母鼠进行超数排卵处理,增加其卵巢上卵泡发育、成熟的数量,再配合使用人绒毛膜促性腺素(human

chorionic

gonadotropin,hCG)或促黄体素(luteinizing

hormone,LH)促进卵泡的最后成熟与排卵,最后就可以从输卵管采集到较多数量的卵母细胞。一般情况下,达到性成熟的小鼠在超排时排卵数多于成年鼠,故常用刚达到性成熟的青年母鼠进行超排。三、实验材料和用具1、清洗用品、消毒和灭菌用品与液体配制

。2、设备与器材微量电子天平、恒温水浴锅、隔水式恒温培养箱、实体显微镜、药勺、青霉素瓶、胶布、记号笔、注射器。1mL、2mL、5mL)、针头(5号、5号半、9号)、针头盒、银子、擦镜纸、器械盘、手术剪、手术慑子、眼科剪、眼科慑子、眼科异物针、表面皿、卵母细胞吸管及胶头、检卵杯、移液器、移液器架、移液器吸头、吸头盒、酒精灯、废物瓶。3、药品、试剂与液体生理盐水、孕马血清促性腺素(PMSG)、人绒毛膜促性腺素(hCG)、1%透明质酸酶溶液、用HEPES缓冲的含BSA的KSOM液或CZB液或加有BSA的mD-PBS液(配制100μg/mL透明质酸酶溶液)、卵母细胞操作液(5%-10%血清mD-PBS液,或HEPES缓冲的KSOM液或CZB液)。4、实验动物及准备昆明系鼠。选择母鼠40-60日龄，体重22-28kg。四、实验步骤1.超排处理于实验开始的当天(0d)下午3:00-5:00,选择阴门淡粉红色的雌性青年小鼠,这时小鼠正处于临近发情开始前,进行超数排卵处理效果较好。保定小鼠后,腹腔注射PMSG8-10IU。于注射PMSG后的48-50h(2d后的下午5:00-7:00),再给每只超数排卵鼠腹腔注射hCG8-10IU,15-17h(3d后的上午)后,从输卵管壶腹部采集卵丘-卵母细胞复合体。2.卵母细胞采集及结构观察颈椎脱臼法处死实验小鼠,用75%的酒精棉球消毒腹部。在下腹部中间剪开一个小口,两只手或用镀子分别抓起切口的上下部皮肤向头部和尾部牵拉,直到充分暴露腹部。切开腹膜,将内脏向上翻,即暴露两侧卵巢和输卵管。用眼科镊子夹住子宫与输卵管连接处,用剪刀剪开输卵管系膜，之后先剪断卵巢和输卵管之间的联系结构，再剪断子宫与输卵管连接处(留大约1cm长的子宫角),即得到输卵管部分。将输卵管转移到盛有卵母细胞操作液的表面皿中。用眼科剪尽量除去输卵管上的脂肪,并冲洗干净,以免血液或脂肪球混入液体妨碍检卵。然后移入另一个盛有卵母细胞操作液的表面皿或平皿中。由于小鼠输卵管非常细,不容易直接冲洗管腔,将表面皿置于实体显微镜载物台上,在20倍或40倍镜下找到输卵管膨大部（壶腹部），用一支眼科异物针固定输卵管,用另一支异物针撕开壶腹部,一般情况下,卵丘-卵母细胞团会自动移出。初学者如对输卵管膨大部判断不准时,可用异物针纵向撕开整个输卵管。此时,卵母细胞周围包裹卵丘细胞,多个卵聚集成积云状。检出两侧卵丘-卵母细胞团,移到含100μg/mL透明质酸酶液中脱去卵丘细胞,卵母细胞就会分散成单个细胞。操作时放在实体显微镜下观察,卵丘层开始扩散时立即停止处理。用较细的吸管吸出卵母细胞到检卵杯中,用卵母细胞操作液洗3次,在实体显微镜下观察卵母细胞的形态结构。卵母细胞通常为圆球形。小鼠卵母细胞较小,直径为70-90μm,由