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文档简介

DNS-Cl法测定胰岛素的N末端

实验二

二甲氨基萘磺酰氯与氨基酸(多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白质），可在紫外光照射下发出可见的荧光。灵敏度10-10摩尔。DNS－Cl标记氨基酸N末端DNS化反应胰岛素DNS标记胰岛素N末端用DNS-Cl标记胰岛素两条肽链的N末端

（A链N末端是Gly，B链N末端是Phe）DNS-胰岛素在6.0mol/L的盐酸中水解，释放出带有DNS荧光标记的DNS-Gly和DNS-Phe。（其他的氨基酸残基不带DNS荧光标记）DNS-胰岛素的水解DNS标记氨基酸标准品的N末端用DNS-Cl标记氨基酸标准品的N末端

（本实验只标记Gly和Phe两种氨基酸标准品）聚酰胺薄膜层析

分离原理：各种被分离化合物在展层剂中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度差异。

聚酰胺：己二酸和己二胺的聚合物（分子中含有大量的酰胺基团）nHOOC(CH2)4COOH+nH2N(CH2)6NH2→-HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO-己二酸

己二胺

聚酰胺

聚酰胺聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜：将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥后制得的薄膜。薄膜含有-CO-和-NH-基团，能与被分离的化合物形成氢键，可以分离酚类、酸类、醌类、硝基及胺基等化合物。Rf值（相对迁移率）A：样品起点C：层析终止时样品的色层中心B：溶剂前沿BC2AC1Rf=AC／AB实验操作1、取1支小试管（试管一定要清洗干净！）

0.2mL胰岛素+0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40ºC水浴反应20min3、在酒精灯上将液体蒸干DNS-Cl标记胰岛素老师准备！直接点样DNS-胰岛素的水解1、加0.5mL6.0mol/LHCl，封口2、110ºC水解12-18小时3、在电炉上蒸发干液体4、加入0.1mL1.0mol/LHCl1、取2支小试管（试管一定要清洗干净！）

Phe管：0.2mlPhe

＋0.2mlDNS-Cl

Gly管：0.2mlGly

＋0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40ºC水浴反应20min3、在酒精灯上将液体蒸干4、各加入0.1mL1.0mol/LHCl

DNS-Cl标记氨基酸标准品1、将0.1mLDNS-Gly、0.1mLDNS-Phe分别转入做好标记的小离心管中。2、各加入0.1mL乙酸乙酯，盖好盖子，振荡混合后静置萃取2分钟。DNS-氨基酸的萃取取2只0.5mL小塑料离心管，做好标记（Gly、Phe）

点样注意：1、用铅笔轻轻标记点样点2、点样点距薄膜底端1.5cm3、用玻璃毛细管点样展层及结果观察展层剂：甲酸（88%）：水=1.5：100（V/V）

1、展层10-15分钟，等溶剂前沿到达距薄膜顶端1.0cm时，停止展层2、标记溶剂前沿3

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