《本科生分子生物学》课件

本科生分子生物学揭示生命奥秘的分子基础探索核酸和蛋白质的结构与功能课程目标和学习要求掌握核心概念理解分子生物学基本理论和原理实验技能培养熟悉主要实验技术和操作方法分析能力提升培养科学思维和问题解决能力应用能力发展分子生物学的发展历史1早期探索阶段1869年：米歇尔发现DNA2基础奠定阶段1953年：沃森和克里克提出DNA双螺旋结构3分子机制阶段1961年：遗传密码破译开始4技术革命阶段1975年：DNA测序和重组DNA技术兴起5基因组学时代2003年：人类基因组计划完成核酸的化学组成五碳糖DNA含2-脱氧核糖RNA含核糖含氮碱基嘌呤：A和G嘧啶：C、T(DNA)和U(RNA)磷酸基团连接核苷酸形成骨架提供负电荷核苷酸碱基+糖+磷酸核酸的基本单位DNA的结构双螺旋结构两条多核苷酸链围绕同一轴盘旋碱基配对A-T配对（双氢键）G-C配对（三氢键）反向平行排列两链方向相反：5'→3'和3'→5'结构参数每转34Å，含10个碱基对RNA的结构和类型mRNA信使RNA，携带遗传信息提供蛋白质合成的模板tRNA转运RNA，运送氨基酸具有独特的三叶草结构rRNA核糖体RNA，构成核糖体参与蛋白质合成其他RNAmiRNA、siRNA、lncRNA等参与基因表达调控核酸的理化特性紫外吸收特性最大吸收波长260nm变性后吸光度增加（增色效应）热变性特性高温导致双链分离Tm值与GC含量正相关复性特性温度降低可重新形成双链是核酸杂交技术的基础蛋白质的结构与功能酶催化功能催化生化反应防御功能抗体参与免疫防御运输功能血红蛋白运输氧气结构功能胶原蛋白提供结构支持信号传导激素和受体介导信号传递氨基酸的结构与性质氨基酸基本结构：α-碳原子连接氨基、羧基和R基团按R基团分类：非极性、极性不带电、带正电、带负电肽键的形成与蛋白质一级结构氨基酸游离状态的氨基酸分子缩合反应羧基与氨基缩合失水肽键形成C-N共价键连接氨基酸一级结构氨基酸线性排列顺序蛋白质的二级结构α螺旋骨架原子排列成右手螺旋每圈3.6个氨基酸残基相隔4个残基的NH和CO形成氢键β折叠肽链呈锯齿状排列相邻肽链间形成氢键分为平行和反平行两种无规则卷曲不规则排列区域常在蛋白质表面具有较高柔性蛋白质的三级结构和四级结构三级结构整个多肽链的三维折叠构象由多种化学键和作用力稳定：疏水作用氢键盐桥二硫键四级结构多个亚基的空间排列组合亚基间相互作用形式：非共价键相互作用同源或异源多聚体对称或非对称排列结构稳定性影响因素包括：温度pH值离子强度变性剂DNA复制的基本概念复制起始DNA解旋，形成复制起始点链延伸DNA聚合酶合成新链校对修复检查并纠正错误配对复制终止完成DNA分子复制原核生物DNA复制1复制起点单一环状染色体上只有一个oriC2复制方向双向复制，形成两个复制叉3复制速度约1000个核苷酸/秒30完成时间约30-40分钟完成整个基因组复制真核生物DNA复制多起点复制每条染色体上有多个复制起点特定时间复制S期完成DNA复制复制单位复制子是独立复制的DNA片段端粒复制需要特殊的端粒酶DNA复制的酶系统拓扑异构酶解除DNA超螺旋解旋酶解开DNA双链单链结合蛋白稳定单链DNA引物酶合成RNA引物DNA聚合酶合成新DNA链连接酶连接DNA片段DNA复制的起始识别起点起始蛋白识别特定DNA序列DNA解旋解旋酶打开双螺旋引物合成引物酶合成短RNA引物复制起始DNA聚合酶开始链延伸DNA复制的延伸领先链：连续合成，5'→3'方向滞后链：不连续合成，形成冈崎片段DNA聚合酶仅能从3'端添加核苷酸DNA复制的终止复制叉会合两个复制叉相遇DNA解旋停止解旋酶活性终止连接末端连接酶连接DNA末端分子分离两个完整DNA分子分开DNA修复机制碱基切除修复识别并切除错误碱基修复小型DNA损伤核苷酸切除修复切除含损伤的DNA片段修复紫外线损伤错配修复识别并修复碱基错配提高复制准确性双链断裂修复连接断裂的DNA双链修复放射线损伤转录的基本概念转录起始RNA聚合酶结合启动子链延伸按DNA模板合成RNA转录终止RNA聚合酶脱离模板RNA加工转录产物进行修饰RNA聚合酶的结构和功能原核生物RNA聚合酶核心酶(α2ββ')加σ因子RNA聚合酶I转录rRNA前体RNA聚合酶II转录mRNA和大多数snRNARNA聚合酶III转录tRNA和5SrRNA原核生物的转录过程启动子识别σ因子识别-10和-35区DNA解链形成转录泡核苷酸添加5'→3'方向延伸RNA链终止信号Rho依赖或非依赖终止真核生物的转录过程转录前起始组装前起始复合物招募基本转录因子形成闭合复合物转录起始形成开放复合物合成短链RNA脱离启动子区域转录延伸RNA聚合酶II活性增强延伸因子参与同时进行RNA加工转录终止识别多聚A信号终止因子结合RNA和DNA模板分离转录后加工：RNA剪接识别剪接位点5'和3'剪接位点序列特异性剪接体组装snRNP和蛋白质形成剪接体内含子切除两步转酯反应切除内含子外显子连接相邻外显子连接形成成熟RNA转录后加工：RNA修饰5'帽子结构加入7-甲基鸟苷酸帽RNA甲基化特定位点甲基化修饰RNA编辑碱基插入、删除或替换3'聚A尾添加多聚腺苷酸尾巴遗传密码及其特点三联体：每三个核苷酸编码一个氨基酸简并性：多个密码子可编码同一氨基酸无重叠：密码子之间无重叠通用性：大多数生物共用相同密码翻译的基本概念密码解读将核酸语言转换为蛋白质语言参与分子mRNA、tRNA、核糖体和辅助因子基本过程起始、延伸、终止三个阶段能量需求需要GTP水解提供能量tRNA和氨基酰-tRNA合成酶tRNA结构三叶草二级结构L形三级结构功能区域反密码子：识别mRNA密码子接受臂：连接氨基酸合成酶特异性每种氨基酸对应特定合成酶高度识别特异性反应过程两步反应消耗ATP能量核糖体的结构和功能原核生物核糖体70S核糖体30S小亚基：16SrRNA和21种蛋白50S大亚基：23S和5SrRNA及34种蛋白真核生物核糖体80S核糖体40S小亚基：18SrRNA和33种蛋白60S大亚基：28S、5.8S和5SrRNA及49种蛋白功能位点A位：接受位点P位：肽基位点E位：退出位点PTC：肽基转移中心翻译的起始起始复合物形成原核生物：30S亚基结合mRNA和起始tRNAIF1、IF2和IF3参与识别SD序列和AUG密码子起始复合物形成真核生物：43S前起始复合物形成结合mRNA形成48S复合物扫描机制寻找AUG密码子多种eIF因子参与完整核糖体组装大亚基结合，形成完整核糖体起始因子释放准备进入延伸阶段翻译的延伸氨基酰-tRNA结合EF-Tu/eEF1A携带tRNA进入A位肽键形成P位多肽链转移至A位氨基酸移位EF-G/eEF2促进核糖体移位循环A位空出准备接受下一个tRNA翻译的终止1终止密码子UAA、UAG或UGA进入A位2释放因子结合RF1/RF2(原核)或eRF1(真核)识别终止密码子3多肽链释放催化酯键水解，释放新合成蛋白质4核糖体解离核糖体亚基分离，可重新参与翻译翻译后修饰蛋白质剪切去除信号肽或前导序列化学基团添加磷酸化、糖基化、甲基化等二硫键形成稳定蛋白质三维结构亚基组装多亚基蛋白质的组装成熟定位运输转运至正确细胞位置原核生物基因表达调控：操纵子模型操纵子组成启动子：RNA聚合酶结合位点操作子：调控蛋白结合位点结构基因：编码蛋白质负调控模式抑制物阻断基因表达诱导物解除抑制例如：乳糖操纵子正调控模式激活蛋白激活转录通常响应环境信号例如：阿拉伯糖操纵子乳糖操纵子抑制状态无乳糖环境下抑制物结合操作子RNA聚合酶无法转录诱导状态乳糖存在环境下乳糖与抑制物结合抑制物构象改变无法结合操作子基因产物β-半乳糖苷酶透酶硫代半乳糖苷酰转移酶色氨酸操纵子抑制状态激活状态色氨酸过多时：抑制物与色氨酸结合，抑制物活化，结合操作子，阻止转录色氨酸缺乏时：抑制物无活性，不能结合操作子，允许转录负反馈机制：产物过多时抑制自身合成真核生物基因表达调控：转录水平顺式作用元件DNA上的调控序列：核心启动子近端启动子增强子沉默子应答元件反式作用因子调控蛋白质：基本转录因子特异性转录因子辅激活因子辅抑制因子染色质结构调控影响DNA可及性：染色质重塑组蛋白修饰DNA甲基化真核生物基因表达调控：转录后水平可变剪接一个基因产生多种mRNAmRNA稳定性调控RNA降解速率mRNA定位控制RNA转运和亚细胞定位翻译抑制miRNA和siRNA调控机制表观遗传学调控定义特点不改变DNA序列的遗传现象可遗传至子代细胞受环境因素影响可逆性修饰主要机制DNA甲基化组蛋白修饰非编码RNA调控染色质重塑生物学意义基因表达精细调控细胞分化和发育基因组稳定性维持环境适应性反应DNA甲基化甲基化建立DNMT3催化从头甲基化甲基化维持DNMT1维持DNA复制后甲基化模式甲基化去除TET酶催化主动去甲基化基因沉默启动子甲基化抑制基因表达组蛋白修饰乙酰化：中和赖氨酸正电荷，松弛染色质，激活转录甲基化：可激活或抑制转录，取决于位点和程度磷酸化：参与染色质凝聚和DNA修复泛素化：调控蛋白稳定性和活性非编码RNA调控miRNA21-23nt，转录后抑制siRNA21-25nt，靶向mRNA降解piRNA26-31nt，沉默转座子lncRNA>200nt，多种调控功能circRNA环状RNA，miRNA海绵基因重组的基本概念1遗传多样性产生新的基因组合DNA修复修复受损DNA3基因组稳定性维持染色体完整性进化动力加速物种适应和进化同源重组双链断裂DNA双链断裂形成同源序列搜索RecA/Rad51介导搜索配对链侵入与置换形成D-loop结构Holliday结构形成形成十字结构中间体解析与连接切割解析重组产物位点特异性重组1特异位点识别重组酶识别特定DNA序列2DNA断裂切割特定识别位点DNA交换DNA片段交换位置4DNA连接DNA末端重新连接转座子和基因重排DNA转座子"剪切-粘贴"机制完全离开原位置例如：Tn5，Tn10RNA转座子"复制-粘贴"机制通过RNA中间体例如：反转录转座子生物学意义基因组多样性基因表达调控染色体结构改变基因工程的基本原理目的基因获取PCR扩增或合成DNA酶切限制性内切酶切割DNA连接连接酶催化连接转化宿主重组DNA导入宿主细胞筛选鉴定鉴定目的克隆限制性内切酶和DNA连接酶限制性内切酶特点：识别特定DNA序列在特定位点切割产生平端或粘性末端分类：I型：复杂、随机切割II型：简单、特定位点切割III型：需ATP，切割识别序列附近DNA连接酶功能：催化DNA片段连接形成磷酸二酯键修复DNA断裂种类：T4DNA连接酶：需ATPE.coliDNA连接酶：需NAD+克隆载体系统3质粒载体复制起点抗性标记多克隆位点噬菌体载体容量较大高效包装λ或M13噬菌体人工染色体BAC、YAC、PAC可容纳大片段稳定传递穿梭载体多宿主复制多种选择标记便于表达检测PCR技术原理及应用变性95℃使DNA双链分离退火50-65℃引物与模板结合延伸72℃DNA聚合酶合成互补链循环30-40次循环指数扩增目标序列基因表达系统原核表达系统：高效但无翻译后修饰真核表达系统：翻译后修饰完善但成本高诱导性表达：通过诱导剂控制表达水平基因组学概述结构基因组学DNA序列测定和分析功能基因组学基因功能和表达研究比较基因组学不同物种基因组比较计算基因组学基因组数据计算分析转录组学和蛋白质组学转录组学研究对象：全部RNA转录物转录水平基因表达主要技术：RNA-Seq芯片杂交单细胞测序蛋白质组学研究对象：全部蛋白质产物蛋白质表达与修饰主要技术：质谱分析蛋白质芯片蛋白质互作组生物信息学基础序列分析：比对、搜索和进化分析结构预测：蛋白质和RNA二级、三级结构功能注释：预测基因和蛋白质功能系统生物学：整合多组学数据分析CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9系统组成Cas9核酸酶sgRNA引导分子工作原理sgRNA识别目标序列Cas9切割DNA双链细胞修复机制修复断裂编辑方式非同源末端连接：基因敲除同源定向修复：精确编辑碱基编辑：单碱基修改分子生物学在医学中的应用分子诊断核酸检测技术诊断疾病基因治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