发育生物学发育生物学研究技术

发育生物学研究技术发育生物学发育生物学研究技术课件第1页1/48惯用发育生物学研究技术介绍显微镜技术(成像imaging);组织切片技术(经典解剖形态学morphology);生化分子生物学;原位杂交技术(insituhybridization);显微注射;汇报基因技术;细胞标识技术;发育生物学发育生物学研究技术课件第2页2/48显微镜技术目标：观察胚胎个体分类：

光学(optical)显微镜:体视显微镜:组织分离用

荧光显微镜：发育生物学发育生物学研究技术课件第3页3/48显微镜技术激光共聚焦显微镜(laserconfocal)：荧光标识，对胚胎或细胞中特定蛋白质或mRNA分布进行定性或定量研究；图像采集效果很好；细胞或组织三维重塑(reconstructing)发育生物学发育生物学研究技术课件第4页4/48组织切片技术目标：观察胚胎内部组织学结构分类：石蜡组织切片：石蜡包埋，切片机切片冷冻切片：低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样品中核酸保留很好，但切片质量差。发育生物学发育生物学研究技术课件第5页5/48分子生物学技术目标：检测目标基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中表示分类：Polymerasechainreaction(PCR):DNAamplificationReal-timequantitativePCR:RNA定量RT-PCR/Northernblotting:mRNA

expressionWesternblotting:protein

expression

免疫共沉淀

(Co-IP):protein-proteininteraction发育生物学发育生物学研究技术课件第6页6/48NorthernBlottingAnalysis发育生物学发育生物学研究技术课件第7页7/48SouthernBlottingAnalysis发育生物学发育生物学研究技术课件第8页8/48Real-timePCR仪发育生物学发育生物学研究技术课件第9页9/48原位杂交技术目标：检测某一特定基因mRNA在某胚胎和组织中分布情况分类：放射性标识探针：放射自显影非放射性标识探针：地高辛(DIG)-免疫组化

荧光素-荧光免疫组化(FISH)发育生物学发育生物学研究技术课件第10页10/48原位探测基因表示

GeneexpressingguidingdevelopmentWhenandwhereparticulargenesareactiveIntactembryosorsectionsofembryosInsituhybrid:probes-radioactiveisotope,fluorescencetagoranenzymeDectection:autoradiography,fluorescencemicroscope,enzyme-substratereaction发育生物学发育生物学研究技术课件第11页11/48原位探测基因表示发育生物学发育生物学研究技术课件第12页12/48原位探测基因表示DistributionofmRNAforthegrowthfactorVg-1intheamphibianegg.Insituhybridizationwitharadioactiveprobe.(yellowsignals)发育生物学发育生物学研究技术课件第13页13/48原位探测基因表示发育生物学发育生物学研究技术课件第14页14/48利用原位杂交技术研究基因表示时空谱mRNA检测发育生物学发育生物学研究技术课件第15页15/48FISH探测基因表示发育生物学发育生物学研究技术课件第16页16/48报道基因(reportergene)技术目标：用于开启子/增强子分析研究。采取一些产物易于检测基因(报道基因)与待研究表示调控序列串联，经过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产物表示来研究目标片断转录调整活性。惯用报道基因分类：

绿色荧光蛋白(GFP):分布用荧光显微镜观察

lacZ基因:编码β-半乳糖苷酶,用特异底物显色研究其产物分布

荧光素酶(luciferase):惯用体外基因表示活性分析，近年开始体内研究发育生物学发育生物学研究技术课件第17页17/48开启子活性检测法表示载体构建：发育生物学发育生物学研究技术课件第18页18/48利用大分子间相互作用克隆新基因判定可与蛋白质结合DNA序列分离靶蛋白质，（可采取gel-shiftassay)克隆靶蛋白表示基因。利用DNA与蛋白质间相互作用发育生物学发育生物学研究技术课件第19页19/48分离时空特异性表示基因方法利用蛋白质之间相互作用酵母双杂交法发育生物学发育生物学研究技术课件第20页20/48显微注射及细胞标识技术目标：将外源DNA、RNA或标识物等导入早期胚胎细胞中，如利用细胞标识技术对胚胎早期卵裂球分化命运图谱研究。在小鼠和果蝇中惯用于转基因分析。细胞标识物分类：早期：活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标识胚胎内部组织现在：细胞外-亲脂性荧光染料如DiI/Dio，不适于组织切片细胞内-荧光标识葡聚糖和HRP，需显微注射，经过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。

示踪基因：GFP和LacZ基因发育生物学发育生物学研究技术课件第21页21/48染料细胞标识发育生物学发育生物学研究技术课件第22页22/48荧光细胞标识发育生物学发育生物学研究技术课件第23页23/48细胞移植发育生物学发育生物学研究技术课件第24页24/48DNA/蛋白芯片目标：高通量筛选不一样胚胎细胞或组织中基因/蛋白表示图谱，取得不一样时期或组织差异表示基因或蛋白。DNAchipProteinchip

microRNAchip分类：发育生物学发育生物学研究技术课件第25页25/48发育生物学发育生物学研究技术课件第26页26/48应用DNAmicroarrays研究基因表示Highoutputscreeninggenesexpresseddifferentlyindifferenttissuesoratdifferentstagesindevelopment发育生物学发育生物学研究技术课件第27页27/48基因组时代：人类基因组计划控制发育基因判定及其表示和功效检测方法发育生物学发育生物学研究技术课件第28页28/48后基因组时代＝功效基因组时代空间结构？胞内分布及靶位？影响器官？基因类型？底物？影响路径？发育生物学发育生物学研究技术课件第29页29/48发育遗传学技术

发育生物学基本任务之一：研究基因在胚胎发育中作用正向遗传学技术：大规模随机诱变，产生发育异常突变个体，然后再寻找突变基因。

1.大规模诱变筛选;2.插入诱变筛选;

3.突变基因克隆;从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因发育生物学发育生物学研究技术课件第30页30/48从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因自然群体中突变体；化学诱变剂处理，如亚硝基－乙脲－乙亚硝基脲(N-nitroso-N-ethylureaethylnitrosourea,ENU)；外源DNA插入法，如DNA注射、病毒感染、转座子利用等；X－射线或r－射线照射取得突变体方法发育生物学发育生物学研究技术课件第31页31/48自发突变

(spontaneousmutation)Recessivemutation(纯合体状态)/Dominant(杂合体状态)

/semi-dominant发育生物学发育生物学研究技术课件第32页32/48自发突变

(spontaneousemutation)semi-dominantmutation(半显性突变)发育生物学发育生物学研究技术课件第33页33/48斑马鱼上ENU化学突变研究成就(1996)从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因化学诱变法发育生物学发育生物学研究技术课件第34页34/48大规模诱变筛选经过射线或化学诱变剂处理父本个体，在其生殖系细胞中产生随机突变，然后与wild-type母本个体杂交，F1个体中可能携带有基因突变。F1与野生型，F2(50%杂合突变体)群体内杂交，F3(25%)可出现纯合突变个体，发育异常发育生物学发育生物学研究技术课件第35页35/48DNA插入诱变法发育生物学发育生物学研究技术课件第36页36/48反转录病毒插入引发突变判定DNA插入诱变法发育生物学发育生物学研究技术课件第37页37/48大规模诱变筛选突变后表型改变：

致死性

功效丧失：最常见。突变后蛋白质比野生型活性差；某一蛋白质完全失活突变为无效突变(nullmutation)

功效取得：如一些受体突变后活化发育生物学发育生物学研究技术课件第38页38/48插入诱变筛选利用转座子(transposon)或病毒载体做诱变剂。果蝇中为P-因子，能够随即插入基因组中，并能够在基因组中移动，包含特殊序列和转座酶，后代生殖细胞中，转座酶就会诱导P-因子在基因中随即转座造成基因突变。发育生物学发育生物学研究技术课件第39页39/48突变基因克隆突变体取得后，克隆引发该突变基因

插入突变：利用P-因子序列作为探针，从突变体文库中筛选出含P-因子克隆，从而确定其插入点及被阻断基因。

化学诱变或射线突变：定位克隆(positionalcloning)—依据目标基因在染色体上位置进行基因分离。经过分析突变位点与已知分子标识连锁关系来确定突变基因染色体位置。惯用分子标识包含单核苷酸多态性(SNPs)。发育生物学发育生物学研究技术课件第40页40/48Positionalcloning:1)确定突变基因染色体定位2)获取该片断基因组序列：数据库3)生物信息学确定该片段可能含有基因，结合其可能功效和该突变体表型，确定候选基因4)试验验证：功效异常，野生型rescue,RNAi发育生物学发育生物学研究技术课件第41页41/48发育遗传学技术反向遗传学技术：经过功效丧失(lossoffunction)或功效取得(gainoffunction)试验，研究胚胎个体所产生表型而分析目标基因功效。

基因修饰

1.基因敲除;2.条件基因敲除;

3.转基因;发育生物学发育生物学研究技术课件第42页42/48Constructingknockoutmice取得携带有特定基因突变个体技术，研究基因在发育中功效主要方法。1)构建用于基因重组突变基因结构2)重组基因导入胚胎干细胞(ES)3)注射ES入胚胎中以取得杂合性小鼠4)小鼠杂交取得纯合体小鼠并进行表型分析。发育生物学发育生物学研究技术课件第43页43/48Conditionalknockout仅使靶基因在特定组织或发育时期失活。Cre-lox

系统

1)Cre编码一个重组酶，可识别并结合位点并切除位于两个LoxP位点之间序列。2)两个品系：靶基因两侧都加入LoxP位点;转入由组织特异性开启子控制cre基因3)小鼠杂交，cre基因会在特异性组织中表示，切除靶基因，使之失活。发育生物学发育生物学研究技术课件第44页44/48Transgenictechnique1)将外源基因注射到受精卵细胞核中，缺点是无法控制外源基因插入情况，只能经过后代检验DNA。2)将外源基因转化到ES中，同geneknockout3)小鼠杂交。发育生物学发育生物学研究技术课件第45页45/48发育遗传学技术反向遗传学技术：

经过抑制性因子抑制目标基