2024年中图版高中生物考点加强课6限制酶的选择原则

1.限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切點确定限制酶的种类①应选择切點位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切點位于目的基因内部的限制酶，以防破壞目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。③為防止目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不一样的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要保证质粒上也有這两种酶的切點)，并且這种切點不致于破壞所有的“標识基因”以及启動子和终止子。(2)根据质粒的特點确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以保证具有相似的黏性末端。②质粒作為载体必须具有標识基因等，因此所选择的限制酶尽量不要破壞這些构造，应至少具有一种完好的標识基因，如图乙中限制酶pstⅠ因其會破壞標识基因而不适宜选择。③所选限制酶切點不应位于复制原點处以防破壞复制原點，假如所选酶的切點不止一种，则切割重组後也許會丢失某些片段，若丢失的片段含复制原點区，则切割重组後的片段進入受体细胞後不能自主复制。④所选限制酶，其切點应位于启動子与终止子之间，如图乙中HindⅢ會破壞启動子，EcoRⅠ會破壞终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启動子与终止子之间。(3)参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上標出T－DNA片段，则所选限制酶切點应位于T－DNA片段中，從而有助于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——由于Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不一样)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若运用该片段构建基因体現载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不适宜选择，而丙Ti质粒宜选用。(分析如下)2.目的基因的检测与鉴定(1)界定“標识基因”与“DNA分子杂交技术”在目的基因检测中的作用：①载体上標识基因的標识原理载体上的標识基因一般是某些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵御有关抗生素的能力。當具有抗生素抗性基因的载体進入受体细胞後，抗性基因在受体细胞内体現，使受体细胞可以抵御對应抗生素，因此在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明無质粒转入，當然不會有“目的基因”转入，能存活時必含该载体，原理如下图所示：②“標识基因”筛选後為何還需应用“DNA分子杂交技术”确认目的基因与否转入？經上述环节筛选得到的受体细胞，只是含特定的標识基因的质粒，然而，该质粒上与否成功嵌入了目的基因，還不能确定，故仍需使用“目的基因”作探针，运用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的质粒上与否含目的基因。(2)使用“目的基因”作探针，运用“分子杂交技术”检测目的基因与否转录出特定mRNA。(3)采用“抗原—抗体杂交技术”，從转基因生物中提取蛋白质(作抗原)与對应抗体杂交，根据与否出現杂交带确认目的基因与否“指导”特定蛋白质的合成。(4)采用抗虫、抗病毒等“接种试验”進行目的基因成功体現的“個体生物學”水平的检测。【例证】(·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三個DNA片段上依次表达出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位點，图(b)為某种体現载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答問題：(1)經BamHⅠ酶切後得到的目的基因可以与上述体現载体被酶切後的产物连接，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人运用图(b)所示的体現载体获得了甲、乙、丙三种具有目的基因的重组DNA分子，如图(c)所示，這三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中体現目的基因产物的有，不能体現的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________。图(c)(3)DNA连接酶是将两個DNA片段连接起来的酶，常見的有和，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__________________________。[慧眼识图获取信息](1)三种限制酶切割成果分析(2)体現载体与重组DNA分子分析答案(1)Sau3AⅠ两种酶切割後产生的片段具有相似的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在启動子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者的目的基因均不能被转录(3)E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶1.(·湖南長沙長郡中學月考)下图是运用工程菌(大肠杆菌)生产人生長激素的试验流程。所用的pBR322质粒具有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切點各一种，且三种酶切割形成的末端各不相似，而Ampr表达氨苄青霉素抗性基因，Tetr表达四环素抗性基因。請回答如下有关問題：(1)過程①所用到的组织细胞是，過程④所用的酶是。⑤過程常用溶液处理大肠杆菌。(2)經②過程得到的互补DNA片段，称為。(3)假如用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對图中质粒進行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割時形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割時形成的DNA片段种类(填“相似”或“不一样”)，這些种类的DNA片段中具有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有种和种。(4)假如只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完毕過程④、⑤後(受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落後用無菌牙签挑取培养基甲上的單個菌落，分别接种到乙和丙两個培养基的相似位置上，一段時间後，菌落的生長状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是。具有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存状况是___________________________________________________________________________________________________________。(5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的過程，属于基因工程基本操作中的______________________________________________________________________________________________________________________环节。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是______________________________________________________________________________________。解析(1)過程①获得的是人生長激素mRNA，因此组织细胞取自人垂体组织细胞；過程④构建基因体現载体的酶是DNA连接酶；過程⑤将基因体現载体导入大肠杆菌前，常用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成為感受态细胞。(2)②過程是人的生長素mRNA逆转录形成cDNA的過程。(3)PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切點分别用1、2、3表达，一种酶酶切時，一共可以得到3种相似長度的片段；两种酶酶切時，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六种片段；三种酶酶切時，可得到1－2，2－3，3－1三种片段，与前面反复，因此用一种酶、两种酶和三种酶分别切割時形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割時形成的DNA片段种类相似。這些种类的DNA片段中具有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有3种和3种。(4)在甲中能生長的是具有四环素抗性的细菌，具有四环素抗性基因；在乙培养基中能生長的是具有四环素和氨苄青霉素抗性的细菌，因此导入的是完整的pBR322质粒或具有Ampr、Tetr的质粒。与丙相比，乙培养基中少了两個菌落，阐明丙培养基中這两個菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，并且目的基因插入质粒後，破壞了氨苄青霉素抗性基因，使具有目的基因的大肠杆菌不能在具有氨苄青霉素的乙培养基上生長，但四环素抗性基因是完好的，则具有目的基因的大肠杆菌能在具有四环素的丙培养基上生長。(5)将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的過程，属于基因工程中的筛选含目的基因的受体细胞环节。该基因工程中的pBR322质粒的化學本质是DNA，其彻底水解的产物是磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基。答案(1)人垂体组织细胞DNA连接酶CaCl2(2)cDNA(3)相似33(4)含四环素抗性基因完整的pBR322质粒(或具有Ampr、Tetr的质粒)在丙中能存活，在乙中不能存活(5)筛选含目的基因的受体细胞磷酸、脱氧核糖、四种含氮碱基2.(·河南名校联盟调研)如图所示為培育转基因细菌的操作流程，回答問題：(1)图中①過程所用工具酶有。為了防止载体和外源DNA自连，应怎样操作？________________________________________________________。(2)當细菌的转化過程中吸取的外源DNA是病毒DNA時，该转化過程又称转染。图中外源DNA来自。為了提高转染效率，应使用处理细菌。(3)图中②過程，重组DNA增殖時需要哪些条件？__________________________________________________________________。(4)图中③過程，筛选含重组质粒的细菌需用到基因的功能。已知所用载体内有青霉素抗性基因和四环素抗性基因两种抗性基因，請写出能在含四环素的培养基上生長，但不能在含青霉素的培养基上生長的细菌即為含外源DNA细菌的前提条件：_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出两點即可)。解析根据转染的定义可知，培育图示转基因细菌的外源DNA应来自(DNA)病毒。此外，限制酶也可以答成限制性核酸内切酶。答案(1)限制酶和DNA连接酶应使用两种限制酶同步切割载体和外源DNA(2)(DNA)病毒Ca2＋(3)模板、原料、酶和能量等(4)標识原细菌不具有青霉素和四环素的抗性基因，外源DNA插入到载体的青霉素抗性基因内部課後·加强训练(時间：15分钟)1.(·全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會导致對应的基因失活(Ampr表达氨苄青霉素抗性基因，Tetr表达四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切後，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶進行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，成果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是具有环状目的基因、具有质粒载体、具有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答問題：(1)质粒载体作為基因工程的工具，应具有的基本条件有___________________________________________________________________(答出两點即可)，而作為基因体現载体，除满足上述基本条件外，還需具有启動子和终止子。(2)假如用品有氨苄青霉素的培养基進行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能辨别的，其原因是___________________________________________________________________；并且和的细胞也是不能辨别的，其原因是__________________________________________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选具有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的單菌落，還需使用品有的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体經改造後可以作為载体，其DNA复制所需的原料来自于_______________________________________________________________。解析(1)作為运载体必须具有如下特點：①能自主复制，從而在受体细胞中稳定保留；②含標识基因，以供重组DNA的鉴定和筛选；③具一种至多种限制酶切割位點以便外源DNA插入。(2)在具有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才可以生長。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中無Ampr，不能在培养基中生長，而仅具有质粒载体的和具有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr因而能在培养基中生長。目的基因的插入破壞了质粒载体的Tetr，故具有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在具有四环素的平板上生長，從而与仅具有质粒载体的大肠杆菌得以辨别。(3)噬菌体是病毒，無细胞构造，無法自主合成DNA，需借助宿主细胞完毕DNA复制。答案(1)能自我复制、具有標识基因(2)两者均不具有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均不生長具有质粒载体具有插入了目的基因的重组质粒(或答具有重组质粒)两者均具有氨芐青霉素抗性基因，在该培养基上均能生長四环素(3)受体细胞2.(·湖北武汉市调研)人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，既有的肝硬化、肝癌多從乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是防止乙肝病毒感染的最有效措施。乙肝疫苗的研制先後經历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之後再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染風险。如图所示為乙肝基因工程疫苗的生产和使用過程(注：质粒中lacZ基因可使细菌运用培养基中的物质X－gal，從而使菌落呈藍色，若無该基因，则菌落呈白色)。請回答問題：(1)過程①最佳选用的限制酶方案可以是。A.EcoRⅤ和BamHⅠB.BamHⅠ和EcoRⅠC.EcoRⅤ和EcoRⅠD.只用BamHⅠ(2)由图中過程③可知，该目的基因的详细功能是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是(写中文全称)。图中過程②常需要用处理，使大肠杆菌细胞转化為感受态细胞。(4)為了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入，培养一段時间挑选出呈(填“藍色”或“白色”)的菌落深入培养获得大量目的菌。(5)用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试從疫苗的构造特點解释原因_____________________________________________________________________________________________________________________________________。解析(1)分析題意可知，切割目的基因和运载体应用相似的限制酶，所用限制酶要保证目的基因的完整性，并且把目的基因插入质粒中，故选用BamHⅠ和EcoRⅠ(用一种限制酶切割時，目的基因和运载体也許會发生自身环化或随意连接)。(2)從過程③可知，目的基因在大肠杆菌体内可体現出乙肝病毒外壳，故该目的基因的功能是指导乙肝病毒外壳蛋白的合成。(3)获取大量目的基因一般采用PCR技术扩增，即多聚酶链式反应。将目的基因导入大肠杆菌细胞的措施一般是用Ca2＋处理细胞，使其变成易于接受外源DNA的感受态细胞。(4)筛选含重组质粒的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素和X－gal，青霉素可以筛选出转入了含目的基因的重组质粒和正常质粒的大肠杆菌，由于重组质粒中lacZ基因被破壞，而lacZ基因可使细菌运用培养基中的物质X－gal，使菌落呈藍色，若無该基因，菌落呈白色，故挑选出白色菌落即可。(5)研制血源性疫苗需灭活破壞乙肝病毒的核酸构造，有也許由于意外原因导致其没有被灭活，导致乙肝病毒在宿主细胞内大量增殖，從而使接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不會引起病毒增殖和感染。答案(1)B(2)指导合成乙肝病毒外壳蛋白(3)多聚酶链式反应Ca2＋(4)青霉素和X－gal白色(5)研制血源性疫苗需灭活破壞乙肝病毒的核酸构造，灭活不成功则會导致接种者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白质，不會引起病毒增殖和感染3.(·河南名校一联)胰岛素是治疗糖尿病的重要药物。現运用基因工程技术让大肠杆菌生产人胰岛素，下图為大肠杆菌质粒，請据图作答：补充阐明：HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ是限制酶切位點tetR、ampR是抗生素抗性基因(1)获取目的基因時，应從人的文库(基因组/cDNA)中获取，這样做的原由于。获取後不能直接對目的基因酶切，由于，因此需要在目的基因两端添加。(2)天然人胰岛素不耐储存，可使用蛋白质工程對蛋白质進行改造。蛋白质工程的基本途径為→设计预期蛋白质构造→→找到相對应的脱氧核苷酸序列。答案(1)cDNAcDNA中無内含子序列，可以在大肠杆菌中体現對的蛋白质cDNA中只有编码氨基酸的序列，直接酶切會导致基因构造变化BamHⅠ和EcoRI的识别位點(2)预期蛋白质功能推测应有的氨基酸序列4.(