平菇原生质体脱毒技术规程FDIS

B39DB1302唐山市质量技术监督局发布DB1302/T349—2013本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。本标准起草单位：唐山师范学院。本标准主要起草人：范永山、张运峰、张淑红、李小六。DB1302/T349—2013平菇原生质体脱毒技术规程本标准规定了平菇原生质体脱毒的实验室准备、原生质体制备、原生质体再生、鉴定。本标准适用于平菇菌种的原生质体脱毒。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅标注日期的版本适用于本文件。凡是不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T12728-2006食用菌术语GB19172-2003平菇菌种GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测NY/T528-2010食用菌菌种生产技术规程NY/T1743-2009食用菌菌种真实性鉴定RAPD法NY/T1845-2010食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应JJG552-1988血细胞计数板试行检定规程DB1302/T306-2011无公害平菇栽培技术规范3术语和定义GB/T12728-2006中确定的及下列术语和定义适用于本文件。3.1平菇指层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属的主要品种。3.2初始菌株保存于PDA斜面或其它适合培养基内的平菇带毒菌株。平菇病毒病病原和症状见附录A。3.3原生质体脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞。3.4稳渗剂用于维持原生质体形状和功能的渗透压稳定剂。3.5再生菌株指原生质体经过培养获得的单菌落。3.6脱毒菌株2DB1302/T349—2013经过栽培试验，无病毒感染症状的优良再生菌株。4实验室准备4.1实验室要求实验室质量控制规范应符合GB/T27405-2008的规定。4.2仪器和设备4.2.1超净工作台：无菌风的纯度≤0.5个/皿•时(φ90mm培养平皿)，风速可调。4.2.2高压蒸汽灭菌器：温度可控制在121℃。4.2.3水浴锅：温度可控制在25℃~50℃。4.2.4气浴恒温振荡培养箱：温度可控制在10℃~50℃,转速0～200rpm。4.2.5光学显微镜：放大倍数400倍。4.3试剂应使用分析纯试剂，水为GB/T6682-2008规定的水。4.3.1稳渗剂0.6mol/L甘露醇（pH7.0）。配制后在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。4.3.2细胞壁降解酶应采用溶壁酶（Lywallzyme）。4.4培养基4.4.1PD液体培养基称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L沸水中煮20min，然后用三层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g，定容至1L。在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。4.4.2PDA固体培养基在1LPD液体培养基中加入琼脂粉15g，加热煮沸15min。在高压蒸汽灭菌器中，121℃灭菌20min。4.4.3PSA固体培养基称取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L稳渗剂中煮20min，然后用三层纱布过滤，向滤液中加入蔗糖20g，用稳渗剂定容至1L，加入琼脂粉15g，加热煮沸15min。在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌20min。5原生质体制备5.1菌丝体活化在超净工作台中用接种针挑取少许初始菌株的菌丝，接种于PDA平板表面，25℃培养5d～7d。5.2摇瓶培养在超净工作台中用接种铲铲取菌落近边缘处菌丝和少许培养基3～5块，置于含有50mLPD培养基的摇瓶中，25℃、180rpm振荡培养5d。DB1302/T349—20135.3破碎菌丝体在超净工作台中，利用接种针从PD培养基中挑取菌丝球置于重量为G1的1.5mL离心管中，10000rpm离心5min，去掉上清，用天平称重为G2，菌丝体重量G=G1-G2（控制在G=0.1g左右）。用玻璃棒（直径6mm）将菌丝球捣碎。5.4酶解称取0.02g溶壁酶于1mL稳渗剂中，用0.22μm的微孔滤膜过滤（现配现用）。将溶壁酶液加入装有菌丝碎片的离心管中，颠倒混匀。将离心管放置于35℃水浴锅中孵育2.5h左右。每隔30min颠倒混匀一次。5.5原生质体分离利用300目细胞筛过滤酶解产物，获得含有原生质体的滤液。5.6原生质体观察和计数利用光学显微镜观察原生质体。按照JJG552-1988的要求进行原生质体计数。6原生质体再生将制备好的原生质体用稳渗剂稀释至1.0×105个/mL，30℃静置培养过夜；然后按0.5mL/皿均匀涂布在PSA再生培养基上，25℃静置培养，直到平板上长出菌落。将单菌落转接到PDA平板上，22℃~28℃静置培养5d～7d，选择边缘整齐、菌丝致密的再生菌株进行鉴定。7鉴定7.1再生菌株的真实性鉴定7.1.1拮抗反应鉴定将再生菌株与初始菌株对峙培养于同一个PDA平板上，按照NY/T1845-2010的要求进行拮抗反应试验。选择无拮抗反应的再生菌株进行遗传学鉴定。7.1.2遗传学鉴定按照NY/T1743-2009的要求进行。选择与初始菌株具有相似RAPD指纹图谱的再生菌株进行以下鉴定。7.2脱毒菌株的鉴定按照DB1302/T306-2011进行出菇试验，观察无病毒感染症状，获得脱毒菌株。按照NY/T528-2010进行菌种生产，脱毒菌种应符合GB19172-2003的规定。DB1302/T349—2013附录A(资料性附录)平菇病毒病病原和症状A.1病原糙皮侧耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）糙皮侧耳等面体病毒（oystermushroomisometricvirus，OMIV）糙皮侧耳病毒-I（Pleurotusostreatusvirus-I，POV-I）糙皮侧耳病毒-SN（Pleurotusostreatusvirus-SN，POV-SN）A.2症状A.2.1菌丝体感染病毒后多表现于生长速度变缓，菌落边缘