DB51-T 3245-2025 大熊猫基因资源库构建技术规程

DB51/T324大熊猫基因资源库构建技术规程2025-03-19发布2025-04-19实施I前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14基本要求 15大熊猫组织库构建技术 26大熊猫精子库构建技术 27大熊猫体细胞库构建技术 3附录A(资料性)大熊猫资源保存登记表 5附录B(资料性)大熊猫精液与体细胞资源保存相关试剂配制 8本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由四川省林业和草原局提出、归口、解释并组织实施。本文件起草单位：成都大熊猫繁育研究基地。本文件主要起草人：侯蓉、刘玉良、安俊辉、王东辉、陈依娇、陈佳松、蔡志刚、王海瑞、李媛。1DB51/T3245—仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本玻璃器皿使用前宜放入5%稀盐酸中浸泡12h,再用手工或超声波清洗器在加有洗涤剂的温热水中进行刷拭。洗净的玻璃器皿用牛皮纸封口后进行高压湿热灭菌(120℃,20min),干燥后待用。使用之前进行高压湿热灭菌(120℃,20min),干燥后待用。枪头高压湿热灭菌(120℃,20min),干燥后待用。毛巾及纱布清洁后进行高压湿热灭菌(120℃,20min),干燥后待用。胶塞、吸管胶头、移液枪用75%酒精擦拭消毒，待酒精挥发尽后使用。2DB51/T3245—2025合GB/T42398的要求，宜为万级以上的层流室，应配备超净工作台和紫外灯。紫外灯的强度为不少于1.5W/m³,紫外线灯管距地面不应超过2.5m,使用前照射20min~30min。大熊猫死亡后，尽快获取其各类组织样本，宜优先保存脏器组织(如心、肝、脾、肺、肾、卵巢、睾丸),用镊子夹着组织在PBS、生理盐水或无菌水中迅速漂洗样本3次~5次，确保组织无明显的血将组织用眼科剪或手术剪剪成0.2cm³~0.5cm³大小的组织块，装入2mL冻存管中(管壁应标注样本主要信息)。样本宜在-80℃超低温冰箱或液氮中冷冻保存。填写大熊猫组织资源保存登记表(参见表A.1)。清理大熊猫直肠内的粪便，对于位置较深而难以清理的粪便再用接近体温的生理盐水冲洗大熊猫的阴茎及包皮。电极棒加涂石蜡油后插入距直肠末端约1/3处并确保电极区抵住直肠上壁。调节电刺激采精仪，电压2V~6V,一般采用1个~3个刺激系列，电刺激强度由低到高，每个刺激系列之间需间隔1min~5min,出现射精立刻停止刺激，将精液收集到集精杯6.2.1精液采集后，对采精量、pH值并填写大熊猫精液资源保存登记表(参见表A.2)。6.2.2采精量：使用移液6.2.3pH值：使用精密pH试纸(测量区间为pH=6.4～9.7)测量精液的pH值。6.2.4精子密度：取5μL精液，添加995μL3%NaCl溶液，混合均匀后取10μL加入血球计数板(25×16型),在200×相差显微镜下计数。精子密度的计算公式为：密度=A×10⁷个/mL,其中：A为56.2.5精子活力：取5μL精液于载玻片上，加盖盖玻片后在37℃恒温装置的相差显微镜上，可采用目测评定法或计算机辅助分析系统分析法对精子活力进行评估。每个样品至野中精子数≥200个)。直线前进运动的精子为100%者评为1.0级；90%者评定为0.9级；如此类推。6.2.6精子运动状态：精子运动状态评估与活力评估的操作相同，精子向前运动的状态划分为0级～5级，0指不运动，5级指快速向前运动。子(包括头部畸形、颈部和中段畸形、主段畸形和过多的胞浆残余体)的比率，每个样品观察精子总数≥200个。36.3.1稀释：15mL离心管收集精液，稀释液采用37℃水浴精液冷冻液(参见附录B),根据精液密6.3.2平衡：15mL离心管收集稀释后的精液，将离心管置于250mL烧杯(盛有200mL～220mL的37℃水)的中部，4℃冰箱中隔水缓慢降温平衡4h。6.3.4冷冻：采用两步法进行精液冷冻。第1步：将细管放置在冷冻架距离液氮面约7.5cm(温度约为-110℃)处1min;第2步：用止血钳将细管放置在冷冻架距离液氮面约2.5cm处1min(温度约为-180℃),然后将细管放入液氮长期保存。6.3.5登记：对照大熊猫精液资源保存登记表(参见表A.2)进行准确填写，对入库细管的数量、冷按下列要求尽快采集样本并填写大熊猫体细胞资源保存登记表(参见表A.3),每只大熊猫个体至少保存1种细胞，宜来源于以下组织：——脐带：大熊猫幼仔的脐带组织，长度为不小于2cm;——肌肉：死亡大熊猫的肌肉组织，体积不小于2cm³;样本均放置于4℃采样液中，应及时运往实验室。脐带的运输时间不宜超过24h,皮肤的运输时间不宜超过48h,肌肉的运输时间组织不宜超过7d。7.2.1脐带来源细胞：将收集的脐带样本清洗干净，尽可能剪碎一些，37℃下先后用1mg/mLIV型胶原酶与0.25%胰蛋白酶进行消化10min～15min,800×g离心5min收集细胞。7.2.2皮肤来源细胞：将皮肤组织样本用眼科剪剪碎，37℃下先用1mg/mLI型胶原酶消化30min~45min,再用0.25%胰蛋白酶消化20min~30min,800×g离心5min收集细胞。7.2.3肌肉来源细胞：将肌肉组织样本用眼科剪剪碎，37℃下先用2mg/mLI型胶原酶消化30min~45min,再用0.25%胰蛋白酶消化20min~30min,800×g离心5min收集细胞。对于分离的细胞加入对应的培养基(见附录B)重悬后接种于培养皿，放置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，记为原代细胞(PO)。当细胞汇合度达到70%～90%时，进行细胞传代：弃去培养基，用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化2min~5min后终止消化，800×g离心5min收集细胞并使用对应培养基培养，记为P1。P1细胞汇合度达70%～90%时再次传代，此时记为P2,依次类推。7.4.1细胞计数与活率检测：细胞消化、离心后7.4.2微生物检测：入库细胞要求无细菌、真菌、支原体污染，检测技术按照GB/T40365执行。DB51/T3245—4将待冷冻的细胞转入梯度降温盒中，-80℃冰箱过夜后转入液氮进行长期保存。冻存管在使用前需对大熊猫谱系号、细胞类型及冻存日期进行标注。对于每个样本需要至少保存于90%。7.4.4入库登记：填写大熊猫体细胞资源保存登记表(参见表A.3),登记表与冻存管的信息应保持本标准涉及样品的液氮保存，液氮生物容器的安全管理按照GB/T5458执行。5(资料性)表A.1至表A.3给出了大熊猫组织、精液及体细胞资源保存登记表。(呼名/谱系号-组织类型-X)呼名谱系号(XX岁)死亡时间(年/月/日/时)采样时间(年/月/日/时)原因组织类型(心/肝/脾/肺/肾/等)/格子号(年/月/DB51/T3245—20256个体信息备注呼名谱系号采样时间(年/月/日/时)(XX岁)(个活力畸形率(呼名/谱系号-精液-X)(支)置(罐/提(年/月/日/时)7DB51/T3245—个体信息组织采样信息呼名谱系号采样时间(年/月/日/时)组织类型(脐带、皮肤、肌肉等)间(小时)次率(个/管)量(管)(罐/提/架/格子号)(年/月/日/时)DB51/T3245—20258(资料性)表B.1给出了精液冷冻液的配方。甘油青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100×)总体积容量瓶定容至100mL。所需试剂占比应为：蔗糖所占比例为12%,卵黄20%,甘油5%,青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液1%(青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液含有10,000单位/mL青霉素、10,000μg/mL链霉素和29谷氨酰胺)。按比例将冷冻液与鲜精混合稀释，使冷冻精液中的甘油终浓度为3.33%。真菌-抗生素(100×)总体积表B.3给出了脐带来源细胞培养基的配方。试剂青霉素-链霉素-谷氨酰胺(100×)总体积DB51/T3245—9表B.4给出了皮肤来源细胞培养基的配