DB1302T327-2012 克伦特罗等3种β-受体激动剂检测技术规范

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DB130DB1302/T327—2012唐 山 市 地 方 标 准DB1302/T327—2012克仑特罗等3种β-受体激动剂检测技术规范2012-03-01发布 2012-04-01实施唐山市质量技术监督局 发布DB1302/TDB1302/T327—2012前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。本标准起草人：郑百芹、李爱军、张建民、葛怀礼、董李学、蒙君丽、苗建民、肖琎、张晓利、赵纳新。DB1302/TDB1302/T327—2012PAGEPAGE10克仑特罗等3种β-受体激动剂检测技术规范范围本标准规定了猪、牛、羊的尿液和组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种β-受体激动剂残留检验的胶体金免疫层析测定方法、酶联免疫吸附测定方法和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于猪、牛、羊的尿液和组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺单个或混合物残留量的快速集成检测。规范性引用文件GB/T6682-2008分析实验室用水规则和试验方法NY/T763-2004 猪肉、猪肝、猪尿抽样方法农业部1063号公告-3-2008 动物尿液中11种β-受体激动剂的检测 液相色谱-串联质谱法农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中β-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法总体要求（级检测中心采用酶联免疫试剂盒进行检测；市级畜牧水产品质量监测中心采用液相色谱-串联质谱法进行确证检测。抽样方法（肌肉/肝脏NY/T763-2004（肌肉/肝脏）抽样方法参照NY/T763-2004执行。胶体金免疫层析法适用范围本方法适用于猪、牛、羊的尿液和组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺的现场快速检测。方法原理胶体金快速检测试纸条应用了竞争抑制免疫层析的原理，样品中的克仑特罗（沙丁胺醇/莱克多巴胺）在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测限上的克仑特罗（沙丁胺醇/莱克多巴胺）—BSA偶联物的结合。试剂和材料克仑特罗快速检测试纸条/沙丁胺醇快速检测试纸条/莱克多巴胺快速检测试纸条、一次性吸管、一次性塑料手套。样品前处理尿液前处理方法检测前将尿样回温到室温，如尿样浑浊，需3000r/min离心5min后检测或者静置30min。组织（肌肉/肝脏）前处理方法取组织（肌肉/肝脏）样品于均质器中均质1min；称取1.0g（±0.02g）均质物于10mL离心管中，然后加入1mL样品提取液，涡旋1min；放入80℃～100℃水浴中15min，取出冷却到室温，待检。操作方法取出检测试纸条，用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2～3滴（约80μL）于加样孔，液体流动时开始计时，反应5min～8min，根据图1判定结果。图1 结果的判定环境控制胶体金快速检测试纸条进行现场快速检测时，环境温度应控制在10℃～30℃。结果判定阴性（-）：T线和C线都显色，表示样品中克仑特罗（沙丁胺醇/莱克多巴胺）浓度低于检测限。阳线无显色线显色表示样品中克仑特（沙丁胺醇/莱克多巴胺浓度高于检测限。无 效未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效在此情况下用新的试纸条重新测试。注：C线为质控限，T线为检测限。酶联免疫吸附测定法克仑特罗酶联免疫吸附法适用范围本方法适用于猪、牛、羊尿液和组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗残留量的快速筛选检测。方法原理本方法采用直接竞争ELISA法检测样品中的克仑特罗。在微孔板上预包被抗克仑特罗单克隆抗体，样品或标准溶液中的克仑特罗和HRP仪器设备微孔板酶标仪（配备450nm/630nm滤光片）。均质器。振荡器。涡旋仪。离心机（转速3000r/min）。天平（感量0.01g）。..3.7（0μ～00L00μL000μ）。试剂和材料以下所用的试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的二级水。氢氧化钠溶液：1mol/L。盐酸溶液：0.1mol/L。氯化钠溶液：40g/L。40g/L氯化钠－0.1mol/L盐酸混合液：量取70mL40g/L氯化钠溶液、20mL0.1mol/L盐酸溶液加水定容至100mL。克仑特罗酶联免疫检测试剂盒。样品前处理尿液前处理方法取50μL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000r/min，室温离心10min），暂不使用的样品冷冻保存。组织（肌肉/肝脏）前处理方法称取（.02g肌肉肝脏样品于0mLmL4gL氯化钠－.1mol/L10min，3000r/min10min1mol/LpH至5.5～.00μL样品检测测定条件:将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20℃～25℃）平衡30min，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。0LRP0μL。温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温（20℃～25℃）反应30min。1×洗涤液50μ，连续洗板3（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。A按:100L（0～5℃）避光显色15min～20min。0μ50m终止液后5min内读取吸光度值。结果判定计算百分吸光度值式中：

百分吸光度值（%）=

B ×100%B0B：标准溶液或待测样品溶液的吸光度值；B0：0B0绘制标准曲线计算样品中克仑特罗浓度以克仑特罗标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中克仑特罗的浓度。克仑特罗实际含量(μg/kg或μg/L)＝C×D式中：μkg或L；D：样品稀释倍数。(尿液样品稀释倍数：1；组织样品稀释倍数：4)沙丁胺醇酶联免疫吸附法适用范围本方法适用于猪、牛、羊尿液和组织（肌肉/肝脏）中沙丁胺醇残留量的快速筛选检测。方法原理本方法采用直接竞争ELISA法检测样品中的沙丁胺醇。在微孔板上预包被抗沙丁胺醇单克隆抗体，样品或标准溶液中的沙丁胺醇和HRP用OTMB底物系统显色，样品吸光度值与其所含沙丁胺醇量成负相关，与标准曲线比较即可得出沙丁胺醇含量。仪器设备微孔板酶标仪（配450nm/630nm滤光片）。均质器。振荡器。涡旋仪。离心机（转速3000r/min）。天平（感量0.01g）。6.2.3.7微量移液器（20µL～200µL、100µL～1000µL）。试剂和材料以下所用的试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682-2008规定的二级水。氢氧化钠溶液：0.5mol/L。盐酸溶液：0.05mol/L。沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒。样品前处理尿液前处理方法取0.1mL尿液，加入0.2mL样品稀释液以1:2（3倍）稀释待用。若待检样品浑浊，则建议过滤或以离心机3000r/min离心10min，取30μL上清液进行检测。组织（肌肉/肝脏）前处理方法称取g±.02g）已均质组织（肌肉/肝脏样品于0mL离心管中，加入mL.05o/L盐酸溶液，振荡混匀10min，3000r/min离心10min。取上清液0.5mL到2mL离心管后再加入0.25mL.5m/L氢氧化钠溶液、.25mL样品稀释液，振荡混匀；00rmn离心1in。取上清液0μL进行检测。样品检测（20℃～25℃）30min编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。加样：每孔分别加入标准溶液/样品0μL，然后每孔分别加入沙丁胺醇标记RP溶液20μ。温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温（20～25℃）避光反应30min。1×洗涤液50μ3清除的气泡可用干净的枪头戳破）。00μL（0℃5避光显色5mn0mn。测定：每孔加入终止液00μL，轻轻振荡混匀，于50m处用酶标仪测定吸光度值，在加入终止液后5min内读取吸光度值。结果判定计算百分吸光度值式中：

百分吸光度值（%）=

B ×100%B0B：标准溶液或待测样品溶液的吸光度值；B0：0B0绘制标准曲线计算样品中沙丁胺醇浓度以沙丁胺醇标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中沙丁胺醇的浓度。沙丁胺醇实际含量(μg/kg或μg/L)＝C×D式中：C：待测液中沙丁胺醇的含量(μg/kg或μg/L)；D：样品稀释倍数。(尿液样品稀释倍数：3；组织样品稀释倍数：5)莱克多巴胺酶联免疫吸附法适用范围本方法适用于猪、牛、羊尿液和组织（肌肉/肝脏）中莱克多巴胺残留量的快速筛选检测。方法原理本方法间接竞争ELISATMB仪器设备微孔板酶标仪（配450nm滤光片）。均质器。振荡器。涡旋仪。离心机（转速3000r/min）。天平（感量0.01g）。6.3.3.7微量移液器（20µL～200µL、100µL～1000µL）。试剂和材料以下所用的试剂，除特殊注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682-2008规定的二级水。提取工作液的配制（现配现用）201：19匀。取100mL稀释好的提取液加入4.0g氯化钠混合均匀至完全溶解。莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒。样品前处理尿液前处理方法取20µL清亮尿样直接测定（如尿样浑浊必须通过过滤或3000r/min以上，室温离心10min），暂不使用的样品应冷冻保存。组织(肌肉/肝脏)前处理方法称取.0（.0g）已均质组织（组织/肝脏）样品于0mL聚苯乙烯离心管中，加入mL提取0in00rmn0mn20L样品检测（20℃～25℃）30min编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样品孔所在的位置。加标准品//样品20µL到对应的微孔中，随即加入酶标二抗50µL/50µL/25℃避光环境中反30min。洗涤：揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤工作液250µL，充分洗涤3次，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。A和底物溶液B以1:1混合，每孔加入底物混合液100避光静置15min。测定：加入终止液50µL/孔，轻轻振荡混匀，于450nm处用酶标仪测定吸光度值，在加入终止液后5min内读取吸光度值。结果判定计算百分吸光度值式中：

百分吸光度值（%）=

B ×100%B0B00：0绘制标准曲线计算样品中莱克多巴胺浓度以莱克多巴胺标准溶液浓度为X轴，对应的百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样品中莱克多巴胺的浓度。莱克多巴胺实际含量(μg/kg或μg/L)＝C×D式中：C：待测液中莱克多巴胺的含量(μg/kg或μg/L)；D：样品稀释倍数。(尿液样品稀释倍数：1；组织样品稀释倍数：5)液相色谱-串联质谱法3β-受体激动剂液相色谱-串联质谱确证检测法适用范围本方法适用于猪、牛、羊的尿液中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺3种β-受体激动剂的测定，方法检测限为0.1ng/mL，定量限为0.2ng/mL。方法原理样品经氢氧化钠溶液调节pH，叔丁醇、叔丁基甲醚混合液萃取并浓缩后用固相萃取小柱净化，洗脱液浓缩后用含0.2%(v/v)甲酸的水溶液溶解，供液相色谱-串联质谱仪进行检测，内标法定量。试剂和材料除方法另有规定外，试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682-2008中一级水的规定。甲醇：色谱纯。甲酸：色谱纯。氢氧化钠。叔丁醇。叔丁基甲醚。氨水。叔丁醇叔丁基甲醚（60:40）提取液：取叔丁醇60mL，叔丁基甲醚40mL，混匀。氢氧化钠溶液：5mol/L。甲酸水溶液：0.2%(v/v)。氨水甲醇溶液：5%(v/v)。克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺对照品，纯度≥95%。β-受体激动剂贮备液的配制：分别精密称取3种β-受体激动剂类药物对照品，用甲醇配制成浓度各约为1mg/mL的标准贮备液，2℃～8℃冷藏保存，有效期6个月。混合对照品工作液：分别吸取3种β-受体激动剂贮备液，置于一棕色容量瓶中，用0.2%μmL℃8℃1个月。同位素内标：克仑特罗-D9、沙丁胺醇-D3、莱克多巴胺-D5，纯度＞92%。00mL的贮备液。同位素内标工作液：将上述同位素内标贮备液用0.2%甲酸水溶液稀释成40ng/mL的混合工作液。固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱，1mL/30mg，或其他性能类似的小柱。7.1.3.18氮气：纯度99.99%。仪器设备液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾电离源。旋转蒸发仪。离心机：转速大于7000r/min。涡旋振荡器。.22μm天平：感量为0.0001g。00μ。试样制备供试样置于-18℃以下冷冻保存，使用前放至室温，如有混浊，离心后取上清液备用。操作方法提取取叔丁基甲醚.0mL于0mL离心管中，添加内标工作液00μL，充分混匀。用moL氢氧化钠溶液调节pH至9～10，加叔丁醇10mL，充分振荡，7000r/min离心10min，将上清液转移至梨形0.2%甲酸水溶液1.0mL溶解残余物，备用。净化固相萃取小柱先用1mL甲醇，1.0mL水活化。备用液过柱，用1mL0.2%甲酸水溶液和1mL甲2min,用5%氨水甲醇溶液3mL1.0mL.2%.22m液相色谱-串联质谱测定按照农业部1063号公告-3-2008方法进行测定。组织（肌肉/肝脏）3β-受体激动剂液相色谱-串联质谱确证检测法适用范围本方法适用于猪、牛、羊的组织（肌肉/肝脏）中克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺单个或混合物残留量的检测。方法检测限为0.25μg/kg，定量限为0.5μg/kg。方法原理试料中的残留药物经酶解，用高氯酸调pH后高速离心沉淀蛋白，上清液调pH后分别用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法测定。试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺对照品：纯度均＞98.0%。乙酸铵缓冲液（0.2mol/L）：称取15.4g乙酸铵，溶解于1000mL水中，用适量乙酸调pH至5.2。7.2.3.3高氯酸：70%～72%。高氯酸溶液：0.1mol/L。氢氧化钠溶液：10mol/L。乙酸乙酯。叔丁基甲醚甲醇：色谱纯。甲酸水溶液：2%(v/v)。乙腈-水溶液：10%(v/v)。氨水甲醇溶液：3%(v/v)。β/βGlcurndas/ryluftse。（00μmL）00μmL20℃6个月。1μmL.0mL备液至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，-20℃冰箱中保存，有效期为6个月。仪器设备液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾电离源。旋转蒸发仪。离心机：转速大于7000r/min。涡旋振荡器。.22μm天平：感量为0.0001g。00μ。