DB36T-黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范

ICSFORMTEXT点击此处添加ICS号FORMTEXT点击此处添加中国标准文献分类号FORMTEXTDB36DB36/FORMTEXT—FORMTEXTFORMTEXT黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范TechnicalSpecificationforisolationandIdentificationofElizabethkingiamiricolainrananigromaculataFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施江西省市场监督管理局发布DBXX/XXXXX—XXXX前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14设备和材料 15培养基和试剂 26分离与鉴定程序 37操作步骤 48菌种保存及生物安全 5附录 6前言本文件按照GB/T1.1-2020给出的规则起草。本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、南昌大学、江西省农业技术推广中心。本文件主要起草人：刘文舒、王玉柱、郭小泽、李思明、简少卿、李小勇、陈彦良、唐艳强、肖海红。黑斑侧褶黑斑蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范范围本文件规定了黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴定技术规范。本文件适用于黑斑侧褶蛙米尔伊丽莎白菌分离鉴。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求《动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》《中国微生物菌种保藏管理条例》术语与定义毁髓法pithing毁髓针刺入蛙枕骨大孔后，将针后端压平,水平向前进入蛙颅腔,左右摆动，捣毁双侧脑组织脑脊髓。PCRPolymeraseChainReactionPCR是在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，是由于高温变性、低温退火等反应组成1个周期，循环进行，使目的DNA得以快速进行扩增。设备和材料除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备和材料如下：无菌采样袋或商品化采样棉拭子、剪刀一次性接种环无菌培养皿：90mm微量加样器：1µL，2.5µL，10µL，100µL和1000µLTip头（与微量加样器相匹配）1.5ml无菌离心管有冷藏（4℃）和冷冻（－20℃）功能的冰箱恒温培养箱手持式均质器：适用于1.5mL离心管电子天平：最小刻度0.01g显微镜（1000倍）高速冷冻离心机（≥12000r/min）恒温水浴锅PCR仪电泳仪自动凝胶成像系统涡旋仪微波炉无菌工作台培养基和试剂除特殊说明，所有实验用水应符合GB/T6682规定的三级水营养肉汤（附录）非选择性细菌培养基（附录）DNAMarker：1Kb扩增片段长度及引物16SrDNA扩增片段长度：约1500bp上游引物序列：27f5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′下游引物序列：1492r5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′gyrB扩增片段长度：约1200bp上游引物序列：gyrB3F5′-TCCGGCGGTCTGCACGGCGT-3′下游引物序列：gyrB14R5′-TTGTCCGGGTTGTACTCGTC-3′灭菌生理盐水:0.6%10×PCR缓冲液Taq聚合酶（0.5U/µL）dNTPs（2mmol）1.2%琼脂糖凝胶（附录）50×TAE缓冲溶液（附录）1×TAE缓冲溶液（电泳缓冲液）（附录）核酸染料：GelRed分离与鉴定技术流程米尔伊丽莎白菌的确定形态学鉴定挑取疑似单菌落纯化培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌培养基中，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36米尔伊丽莎白菌的确定形态学鉴定挑取疑似单菌落纯化培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌培养基中，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h剪碎或匀浆病变组织采样毁髓法操作低温麻醉病蛙的清洁和体表消毒分子生物学鉴分子生物学鉴定基因测序PCR基因测序PCR操作步骤采样①病蛙采集回实验室后，用清水清洗蛙体，置无菌操作台紫外线灭菌待用；②将病蛙置于冰水混合物中低温麻醉或对病蛙进行毁髓法操作；③待病蛙完全进入麻醉或死亡状态后，取出病蛙，用吸水纸吸去体表水分；④用酒精棉球（75%消毒酒精）对病蛙体表和眼部消毒；⑤将杀菌消毒后的病蛙置于无菌操作台内的托盘上，选取眼部病变明显处，用镊子和手术剪刀进行采样。病菌的培养①在无菌状态下将所采病变组织进行剪碎或匀浆；②将剪碎或匀浆后的组织液与营养肉汤按照1:10比例进行混合，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h，观察；③将培养好的菌悬浊液摇晃均匀，在无菌状态下划线接种于无菌非选择性培养基中，恒温培养箱（36℃±1℃）培养24h，观察；④选取可疑菌落接种于新的无菌非选择性培养基中，温培养箱（36℃±1℃）培养24h，待进一步鉴定。病菌样品的鉴定7.3.1形态学鉴定菌落颜色为米色或淡黄色，边缘整齐，半透明，表面湿润、光滑。7.3.2分子生物学鉴定7.3.2.1PCR模板的制备接种环挑选培养基上待检菌的单独菌落，置于0.5ml灭菌生理盐水中，4000r/min离心2min，弃上清。再加0.5mL无菌水重悬并涡旋混匀，100℃沸水中煮沸10min后，移至冰面上，冷却后4000r/min离心30s，取上清液作为PCR模板待用。7.3.2.2PCR反应体系的配制根据PCR试剂用量，配制PCR反应体系。7.3.2.3PCR反应条件16SrRNA扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸90s，共32个循环，最后72℃延伸10min。gyrB扩增条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环，最后72℃延伸10min。7.3.2.4电泳及成像观察取5µLPCR扩增产物和1µL上样缓冲液，混匀后加入1.2%琼脂糖凝胶电泳加样孔中，同时在空白孔加入Marker标准品。电泳结束后，取出凝胶板置于紫外投射仪上，打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像观察，确定PCR效果。7.3.2.5基因序列测序将扩增产物进行基因序列的测定，在NCBI对比，与已有基因同源性高于98%即可确定为米尔伊丽莎白菌。菌种保存及生物安全为了保护实验室人员的安全，应由具备专业知识的人员进行检测，所有培养物和废弃物应参照GB/T19489及国家有关规定执行。菌种应由具备专业相关资质的实验室根据《动物病原微生物菌（毒）种保藏管理办法》《中国微生物菌种保藏管理条例》进行妥善保存。_________________________________

附录1.营养肉汤（商品化试剂）成分：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；pH值7.2±0.2（25℃）。制作方法：将上述成分混合，加入双蒸水或去离子水中，调整pH值至7.4±0.2，滤清，分装，121℃灭菌15min。2.非选择性细菌培养基成分：蛋白胨10.0g/L；酵母粉5.0g/L；氯化钠10.0g/L；琼脂15.0g/L；pH值7.2±0.2（25℃）。制作方法：将上述成分混合，加入双蒸水或去离子水中，调整pH值至7.4±0.2，121℃灭菌15min，冷却至50℃左右时在无菌状态下倾注适量液态培养基至细菌培养平板中冷却，备用。3.1.2%琼脂糖凝胶称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5×TBE缓冲溶液中，加入核酸染料，微波炉加热至完全融化，依据样品数选用适宜的梳子，将琼脂糖倒入凝胶盘中，胶板厚度