薰衣草蜂蜜植物成分检测实时荧光PCR法编制说明

《薰衣草蜂蜜植物源成分的检测实时荧光PCR法》行业标准编制说明一、工作简况《薰衣草蜂蜜植物源成分的检测实时荧光PCR法》行业标准是根据《中华全国供销合作总社办公厅关于组织申报2023年供销合作社归口标准体系与行业品牌建设及维护项目的通知》(供销厅科社[2023]38号)文件要求，中国计量大学牵头负责《薰衣草蜂蜜植物源求，起草、编制了《薰衣草蜂蜜植物源成分的检测实时荧光PCR法》行业标准(草案)。二、标准制定原则和主要内容说明润肠通便，逐渐受到广大消费者的青睐。由于薰衣草蜂蜜流蜜期短(6月中旬至7月初，以及8月末至9月初),且产地主要来自新疆，更显珍贵稀少。部分蜂农和厂家混入杂花蜜1356-2021,建立了枇杷蜜植物源的检测方法。以上标准均未涉及薰衣草等特有蜜源植物，因此，本项目拟利用real-timeqPCR(TaqM标准起草小组根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》2.2本标准适用于采用实时荧光PCR法测定薰衣草作为蜜源的蜂蜜中特有植物源DNA成分的三、主要试验(或验证)情况分析3.1测定案例样品收集为市售不同规格的薰衣草蜂蜜共10份，其样品信息和波美度、糖度、水分信息如表1所示。表1.薰衣草蜂蜜样品信息3.1.1.2仪器设备实验所涉及到的主要仪器有ThermoFisherscientific公司生产的ST16R冷冻离心机与Legendmicrol7小型离心机；ThermoFisherscientific公司生产的StepOnePlusReal-TimePCRSystem;上海一恒科技有限公司0.5g亚硫酸氢钠和2g聚乙烯吡咯烷酮-40,充分振荡混匀，制成100ml提取工作液。工表2.提取工作液所用试剂配制方法山梨醇23.3g2.4g至8.0,并定容至200mL至8.0,并定容至200mL容量瓶中5%十二烷基肌氨酸钠聚乙烯吡咯烷酮-40分别取25g蜂蜜样品，与30mL无菌水混合，振荡混匀。8000r/min,4℃离心25min。弃上清，将沉淀溶解于1mL(3.1.2.1)现配的工作液中。充分混匀后，于37℃水浴过夜。次日，向样品中加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24:1),缓慢颠倒混匀10min,12000薰衣草(ITS基因)引物和探针详见表3。表3.薰衣草ITS基因扩增引物及探针序列引物/探针序列(5'→3')产物长度(bp)薰衣草F:GCAGCGTTCGGGCTTAAR:CAACTTGCGTTCAAAGACTCP:FAM-GGGCAGCGGGCGTCTATCGAATGTCA3.1.4实时荧光PCR反应3.1.4.1反应试剂和仪器荧光定量PCR仪为ThermoFisherscientific公司生产的StepOnePlusReal-TimePCR实时荧光PCR反应体系配制见表4,所有样品和对照重复2次，配制反应液时尽量避光表4.实时荧光PCR反应体系配制表终浓度荧光PCR反剂(2×)样品总量3.1.4.3反应参数和条件预变性95℃30s,然后95℃5s、60℃30s,45个循环。试验过程中观察PCR荧3.1.4.4结果判定3.1.5薰衣草蜂蜜实时荧光PCR法子、芝麻、椴树、荷、五倍子、石榴、玉米、荆条、枣、紫云英26种植物DNA作为阴性对照，以ddH₂O作为空白对照，对薰衣草ITS基因进行实时荧光PCR扩增，均进行2个重复，3.1.5.2蜂蜜样品实时荧光PCR检测作为空白对照，均进行2个平行重复，检测其植物源是否为薰衣草。3.1.6结果分析取情况如表5所示。表5.薰衣草蜂蜜DNA浓度及其纯度对其他26种植物源成分及空白对照(以ddH₂O代替模板)无扩增，表明薰衣草引物探针具图1.薰衣草ITS基因引物探针特异性检测实注：其中，①为薰衣草DNA(阳性对照组)扩增曲线，② (每一点的荧光强度)-R-n(基线荧光强度),即PCR过程中产物增加的量，横轴为循环数。阳性对照出现典型的扩增曲线(图1-①),若Ct值>30,试验无效。阴性对照应无典型的扩增曲线(图1-②),若出现扩增曲线，或相应Ct值<40,试验无效。空白对照应无典型的扩增曲线(图1-③),若出现扩增曲线，或相应Ct值<40,试验无效。3.1.6.3薰衣草蜂蜜样品实时荧光PCR结果描述及判定(1)在符合3.1.6.2的情况下，结果判定如下：a)Ct值≤35,则判定为阳性。b)Ct值≥40或无荧光对数增长和典型扩增曲线，则判定为阴性。c)35<Ct值<40,则重复实验一次。再次扩增后Ct值<40,则判定为阳性；Ct值≥40,则判定为阴性。由图2及表6可知，空白对照组无典型的扩增曲线，这表明制备PCRMix时使用的各类①②图2.10份蜂蜜样品实时荧光PCR扩增曲线注：其中，①为薰衣草蜂蜜样品扩增曲线，②空白对照组(以ddH₂O代替模板)扩增曲线。表6.薰衣草蜂蜜样品实时荧光PCR检测结果1空白对照3.2验证案例委托黄埔海关技术中心对提供的4个薰衣草蜂蜜DNA样品(编号1~4号),采用1个阳性对照(薰衣草叶片提取的DNA),1个空白对照(以ddH₂O代替DNA模板),6个阴性对照 (油菜、枇杷、荆条、玉米、枣、荔枝的DNA),共12个样品进行了荧光定量PCR盲样检测。检测Ct结果和扩增曲线分别由表7和图3所示，在所有12个样品中，只有1个阳性参照和4个阳性样品(样品1~样品4)有显著扩增，其中阳性参照Ct值平均值为22.95,符合标准文本中的阳性参照Ct值应小于或等于30的规定，且所有阳性样品Ct值均符合标准文本中的阳性样品Ct值应小于或等于35的规定；而6个阴性参照和1个空白参照均未有荧光扩增，符合标准文本中的阴性参照及空白对照Ct值应无荧光对数增长或典型的扩增曲线或应大于或等于40的规定。综上，表明所用薰衣草引物及探针特异性较强，这与本标准文表7.黄埔海关技术中心检测样品Ct值1#样品12#样品23#样品35#空白对照6#阳性对照7#油菜8#枇杷10#玉米11#枣12#荔枝董衣草叶片样品1图3.黄埔海关技术中心样品实时荧光PCR扩增曲线3.2.2天津海关动植物与食品检测中心委托天津海关动植物与食品检测中心对提供的4个薰衣草蜂蜜DNA样品(编号1~4号),采用1个阳性对照(薰衣草叶片提取的DNA,编号6号),1个空白对照(以ddH₂O代替DNA模板，编号5号),6个阴性对照(油菜、枇杷、荆条、玉米、枣、荔枝的DNA,编号7~12号),共12个样品进行了荧光定量PCR盲样检测。检测Ct结果和扩增曲线分别由表8和图4所示，在所有12个样品中，只有1个阳性参照和4个阳性样品(编号1~4号)有显著扩增，其中阳性参照的Ct值平均值为20.58,符合标准文本中的阳性参照Ct值应小于或等于30的规定，且所有阳性样品Ct值均符合标准文本中的阳性样品Ct值应小于或等于35的规定；而6个阴性参照和1个空白参照均未有荧光扩增，符合标准文本中的阴性参照及空白对表8.天津海关动植物与食品检测中心检测样品Ct值123456789AmphificstionCurvesAmphificstionCurves65图4.天津海关动植物与食品检测中心样品实时荧光PCR扩增曲线3.2.3杭州卓兰生物科技有限公司委托杭州卓兰生物科技有限公司实验室对对提供的4个薰衣草蜂蜜DNA样品(编号1~4号),采用1个阳性对照(薰衣草叶片提取的DNA),1个空白对照(以ddH₂O代替DNA模板),6个阴性对照(油菜、枇杷、荆条、玉米、枣、荔枝的DNA),共12个样品进行了荧光定量PCR盲样检测。检测Ct结果和扩增曲线分别由表9和图5所示，在所有12个样品中，只有1个阳性参照和4个阳性样品(样品1~4)有显著扩增，其中阳性参照的Ct值平均值为15.568,符合标准文本中的阳性参照Ct值应小于或等于30的规定，且所有阳性样品Ct值均符合标准文本中的阳性样品Ct值应小于或等于35的规定；而6个阴性参照和1个空白参照均未有荧光扩增，符合标准文本中的阴性参照及空白对照Ct值应无荧型的扩增曲线或应大于或等于40的规定。综上，表明所用薰衣草引物及探针特异性较强，1#样品12#样品23#样品35#空白对照6#阳性对照7#油菜10#玉米11#枣12#荔枝O2O-4其他植物及空白对照0五、预期达到的社会效益、对产业发展的作用等情况六、采用国际标准和国外先进标准的程度七、与现行法律、法规、规章及相关标准，特别是强制性标准的协调性目前有GBT23194-2008蜂蜜中植物花粉的测定方法、进出品行业标准SN/