分子生物学实验省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

分子生物学试验中南民族大学生命科学学院试验教学中心3月第1页试验一植物基因组DNA提取试验二多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测试验三植物总RNA提取试验四蛋白质印迹第2页高等动物，高等植物基因组相当宠大，如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对，水稻基因组有１．４×１０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可表示结构基因，其它大量存在是调控序列和内含子序列。能够说某特定物种基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组结构，组成，以及表示调控研究是至关主要，而研究起点就是要取得纯度高－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－方便有足够量用于分析；基因组相对完整－－断裂基因组方便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库构建，基因探测等研究。试验一植物基因组DNA提取一.试验目标及背景

第3页真核细胞基因组在提取过程中普通有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最终纯化出ＤＮＡ，因为真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大程度地降低机械和化学作用对ＤＮＡ剪切，从而取得相对完整ＤＮＡ。第4页十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。第5页三、试验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2%CTAB抽提缓冲溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml(PH8.0)0.5MEDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。第6页五、试验步骤1.DNA提取

（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。（2）取少许叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（3）加入700ul2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4）将磨碎液分倒入1.5ml灭菌离心管中，磨碎液高度约占管三分之二；（5）置于65℃水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，猛烈振荡2~3min，使二者混合均匀；（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl异丙醇加入另一新灭菌离心管中；第7页（8）10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸收上清夜，转入含有异丙醇离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（10）60sec后，直立离心管，加入720µl75%乙醇及80µl5M醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底DNA块状物浮游于液体中；（9）10000rpm离心1min后，马上倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开纸巾上；第8页（11）放置30min，使DNA块状物不纯物溶解；（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%乙醇，将DNA再洗30min；（13）10000rpm离心30sec后，马上倒掉液体，将离心管倒立于铺开纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50µl0.5×TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；（15）置于-20℃保留、备用。第9页2.DNA质量检测琼脂糖电泳检测，

12345HindIII总DNA第10页六、注意事项

（1）叶片磨得越细越好。（2）移液器使用。（3）因为植物细胞中含有大量DNA酶，所以，除在抽提液中加入EDTA抑制酶活性外，第一步操作应快速，以免组织解冻，造成细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。第11页1.本试验中所用到各试剂作用是什么?CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA2．提取基因组DNA方法有哪些？各有何优缺点？七、问题第12页一．试验目标及背景

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来一个体外扩增特异ＤＮＡ片段技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中取得数百万个特异目标ＤＮＡ序列拷贝，ＰＣＲ技术即使问世仅多年时间，但它已快速渗透到分子生物学各个领域，引发了生物技术发展一次革命，当前它在分子克隆，目标基础检测，遗传病基因诊疗，法医学，考古学等方面得到了广泛应用。试验二PCR试验技术第13页ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶酶促合反应，ＰＣＲ技术特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见下列图。第14页第15页模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链；在５５℃条件下依据目标基因两侧序列设计引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成ＤＮＡ为模板进行一样反应，如次往复循环３０次，因为每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目标DNA量增加１０６－７倍。成功ＰＣＲ反应要求反应有很好特异性，和相当扩增效率。要达此目标ＰＣＲ反应要注意以下问题：二、PCR反应及步骤第16页１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高，以增加反应特异性。２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。３．Mg2+：Mg2+是Taq酶辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。４．引物：依据目标基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。第17页６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是依据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性决定原因。８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。第18页１０×buffer:500mMKCl100mMTris-HCl(pH9.0)0.1%明胶1%TritonX-100MgCl22.5mM４×dNTP:1mM引物：TGGCCGAGCTG5.0uM模板：20ng/μlTaq酶：5u/μlPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统第19页１．向无菌500μlEppendorf管中依次加入以下溶液：反应物体积10×buffer2.5μl4×dNTP(1mM)2.5μlMgCl2(25mM)2.5μl无菌水10.5μlTaq酶(1U/ul)1μl引物2μl模板ＤＮＡ(20ng)4μl总体积25μl第20页2．反应体系混匀，离心3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环94℃变性１分钟36℃退火１分钟72℃延伸２分钟经过40个循环4．72℃延伸反应7分钟。5．取20μl反应液加4μlLoadingbuffer在6.1.5％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。7.在凝胶成像系统上观察统计试验结

第21页三、PCR电泳检测第22页１．统计试验结果，并估测ＰＣＲ扩增产物分子量。四、问题与讨论：１．简述ＰＣＲ基本原理２．进行一次成功ＰＣＲ反应顺注意哪些问题。第23页一、试验目标经过本试验学习从植物组织中提取RNA方法。二、试验原理RNA是一类极易降解分子，要得到完整RNA，必须最大程度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，经过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一总RNA。试验三RNA提取第24页三、仪器、药品与试剂配方(一)

仪器1．

低温离心机2．

分光光度计3．

琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。4．

高压灭菌锅5．

研钵、剪刀、一次性手套等第25页

一、目标和内容目标：掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，掌握蛋白质印迹技术基本原理和方法。内容：本试验采取鸡卵清白蛋白为材料，对此蛋白质进行SDS—PAGE电泳后，用电转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上，将预先制备好鸡蛋清免疫而成抗血清，作为初级抗体，用辣根过氧化物酶标识羊抗兔为第二抗体，在底物存在下，经过显色电泳条带，测定蛋白质性质。试验四蛋白质印迹技术（Westernblotting）第26页二、主要仪器、材料和试剂1、仪器和材料蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套（六一仪器厂），硝酸纤维素滤膜（黄岩化工厂），直径为20cm及10cm玻璃平皿各一个，剪刀、镊子、刀片、一次性手套，普通滤纸，鸡卵清白蛋白，鸡卵清免疫兔抗血清，辣根过氧化酶-羊抗兔抗体（1：500稀释），四氯奈酚或者二氨基联苯胺，过氧化氢。第27页2、试剂（1）TBS要Tris-HClNaCl缓冲液：20mml/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，PH：7.5。（2）TBS要Tris-HClNaCl，Tween-20缓冲液：20mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，0.05%Tween-20，PH：7.5。（3）抗体溶液：牛血清白蛋白质-TBS溶液，1%BSA-TBS。（4）Blocking溶液（封闭液）：10%牛血清-TBS。（5）底物溶液（0.5mg/mL）：25mg四氯奈酚，加5mL甲醇溶解后，加10ml在30℃水浴中温浴TBS溶液，混合后再加50mlTBS，然后再加入10μl30%过氧化氢马上使用。（6）转移缓冲液：25mmol/LTris，192mmol/LGlycine20%MethnolL，pH8.3.（7）去离子双蒸水。第28页1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3.异硫氰酸胍4.醋酸钠(NaAc)5.氯仿6.苯酚7.甲醛8.乙醇9.乙二胺四乙酸(EDTA)10.琼脂糖11.异丙醇第29页(三)试剂配方1.0.1%DEPC水0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3.5ΧMOPS电泳缓冲液(pH7.0)MOPS0.1mol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L第30页四、试验步骤（一）

总RNA提取（方案一）1.试验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10mL离心管。加入4mol/L异硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL氯仿0.6mL混匀，冰浴放置30min。2.4℃，8000r/min，离心13min。3.弃沉淀，取上清至另一洁净无菌离心管中。4.加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5h。5.4℃，8000r/min，离心13min。第31页三、操作操作步骤1、制备兔抗鸡蛋清白蛋白血清将鸡蛋清与生理盐水1：1混匀后，与石蜡有完全佐剂和不完全佐剂研磨而成抗原，选择两只家兔，皮下多点注射3次，每七天一次，加强一次，每次四个点，每点0.2ml抗原，5周后颈动脉放血、取血清作为WesternBlotting第一抗体。第32页6.弃上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl，使其溶解。7.移入1.5mL离心管中，冰浴2h。8.4℃，13000r/min，离心15min。