DB35-T 1995-2021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术

35FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitisI 2 2 3 3 3 4 5 6本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关1禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流禽腺病毒4型fowladenov荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的4疫病概述有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4d后开始死亡，死亡期可持续7d~25.1.1台式冷冻高速离心机（转速5.1.3微量可调移液器（量程分别为100µL～1000µL、20µL～200µL、2µL～20µL、0.5µL~5.2材料和试剂）：5.2.7蛋白酶K、Tris饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇5.2.11阴性对照：Nuclease-freeWate样品采集后应保存在2℃~8℃条件下，24h内送达实验室。超过24h的应保存在-20℃条件下，且时间不应超过7d。如需长期保存，须保存在-70℃~-80℃条件下。取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15s，4℃、5000r/min离心10min，取3取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆，转入1.5mL无菌离心管中，反复冻7.1.3离心后吸取上清液转移至1.5mL无菌离心管（注意不要吸出），），在PCR反应管中分别加入以下试剂：ProbeqPCRmix10µL，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4µL，40个循环；最后保存于4℃。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一9结果判定待检样品Ct值≤32时，且出现典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阳性，见附录B待检样品Ct值＞35时，或无典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阴性，见4必要时可对定量PCR产物进行测序，参考序列5A.1棉拭子稀释液和制霉菌素（5000IU/mL调节pH至7.2～7.4。A.2组织稀释液和制霉菌素（1000IU/mL调节pH至7.2～7.4。称量10g十二烷基硫酸钠，加入90mL灭菌双蒸水，小心搅拌A.575%乙醇量取750mL的无水乙醇加入250mL的a)正向引物FAdV-4-F：5,-CCCGATb)反向引物FAdV-4-R：5,-TGCTAAACTc)探针引物FAdV-4-P：5,-FAM-AACG荧光定量PCR扩增片段为196bp，引物和探针用双蒸水溶解至10µmol/L6以建立的荧光定量PCR诊断技术对2份阳性样品和2份N---阴性对照；选择FAdV-4GDMZ株（GenBank的登录号：MG856954）Hexon基因序列作为参考基因序列：cccgatctcagtcaaattaaactctacaccaacaacaccgccgcgaacgacaaaaacaccgccgtggctaacgccactacc