微生物检验理论课 14衣原体 学习资料

衣原体

chlamydia南方医科大学第三附属医院检验科陈佑明电话62784781邮箱cym38432@163.com教学内容与要求衣原体的生物概念与生物特性衣原体的分类与命名衣原体发育周期及原体与始体的区别对人致病的主要衣原体有哪些对人致病的主要三种衣原体感染患者的取材、培养及微生物学诊断衣原体的生物概念专性细胞内寄生独特发育周期能透过细菌滤器衣原体的主要生物特性有DNA和RNA两种核酸，其DNA为双链有细胞壁，由LPS和蛋白质组成含有核糖体有独特的发育周期细胞间感染相原体(elementarybody)细胞内繁殖相网状体(reticulatebody)行二分裂方式繁殖能量代谢酶系统不完善，表现严格的细胞内寄生对多种抗生素敏感衣原体的发育周期原体→吸附→吞噬体(空泡)→在吞噬体内形成始体→二分裂繁殖→形成包涵体→在包涵体内成熟为原体→释放。

性状原体始体

形态球形或椭圆网状大小（µm）0.2－0.40.5－1.0细胞壁坚硬

柔韧核物质致密稀疏

RNA：DNA1：13：1代谢活性-+胞外稳定性+-感染性+-繁殖能力-+染色性(Giemsa)紫色蓝色原体与始体的区别1.培养特点专性细胞内寄生，可在鸡胚卵黄囊，小鼠和培养细胞中繁殖2.抵抗力抵抗力弱，耐冷怕热，对消毒剂敏感。3.抗原结构与分型

属特异抗原－脂多糖（LPS），位于细胞壁种特异抗原－主要外膜蛋白（MOMP）型特异抗原－MOMP氨基酸可变区，分型依据

其他生物学性状衣原体的致病物质与致病机理致病物质促进衣原体吸附易感细胞，侵入机体阻止吞噬体和包涵体融合，使衣原体得以生存类似革兰阴性菌感染的炎症反应和迟发性变态反应使细胞释放IL-1类细胞因子，导致机体损伤蛋白质LPS致病机理入侵机体→吸附易感细胞→细胞内陷形成包涵体→衣原体分裂繁殖→破坏细胞→释放→感染其它细胞衣原体的分类

沙眼生物变种沙眼衣原体

淋巴肉芽肿变种

C.trachomatis

鼠生物变种肺炎衣原体

C.pneumoniae鹦鹉热衣原体

C.psittaci猫心衣原体

C.pecorum衣原体属衣原体及其所致疾病自然宿主人、小鼠人鸟、低等哺乳牛、羊所致疾病沙眼肺炎鸟、人类肺炎呼吸道感染性病呼吸道感染呼吸道感染幼儿肺炎包涵体糖原＋－－－血清型221(TWAR)不明3磺胺敏感性敏感耐药耐药耐药原体形态圆椭圆梨形圆、椭圆圆沙眼肺炎鹦鹉热家畜衣原体衣原体衣原体衣原体人类是其主要宿主可引起多种疾病，其中以沙眼（能致盲）、泌尿生殖道感染（非淋病尿道炎）常见，还能引起性病淋巴肉芽肿。五十年代，汤飞凡首先用鸡胚卵黄囊接种分离沙眼亚种14个血清型(A,B,Ba,C,D,Da,E,F,G,H,I,Ia,J,K)性病淋巴肉芽肿亚种(LGV)4个血清型（L1，L2，L2a，L3）鼠亚种

4个血清型，不侵犯人沙眼衣原体微生物特性原体较小，Giemsa染色呈紫色，呈圆形或椭圆形，细胞壁致密，具有特殊的发育周期。始体Giemsa染色呈红色，二分裂增繁殖。包涵体具有多形性，碘染色后呈褐色。专性细胞内寄生，可接种鸡胚卵黄囊中生长繁殖，也可以在组织细胞内培养。微量免疫荧光法根据型特异抗原把三种亚种不同的血清型区别。

形态染色：常用Giemsa染色

Giemsa染色：原体（紫色），0.25-0.35um,卵圆形，中央有一致密的拟核网状体（蓝色）,0.5-1.0um，圆形或不规则形,无致密拟核，包含体（深紫色），多见箭头所指为包含体

原体被碘溶液染成棕褐色

致病性与免疫性致病性：

不仅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系统感染、性病淋巴肉芽肿以及其他器官疾病。近年沙眼衣原体的感染率和危害性已超过淋球菌而居性传播疾病之首，因而日益受到医学界的重视，鼠生亚种不致病。沙眼：通过眼-手-眼途径直接或间接密切接触传播，致盲首位。包涵体结膜炎：由沙眼生物变种引起，经产道或污物而感染。非淋菌性泌尿生殖道炎：性接触传播，引起泌尿生殖道感染。性病淋巴肉芽肿亚种：侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿。免疫性产生特异性抗体，抗体持续时间短。也可出现补体结合抗体。衣原体性宫颈炎衣原体性尿道炎沙眼性病性淋巴肉芽肿鹦鹉热衣原体首先从鹦鹉中分离出来，引起的感染成为职业病。生物学性状与沙眼衣原体相似。最适生长温度为39℃，碘染色阴性，对磺胺耐药。耐热抗原与沙眼衣原体LGV亚种有交叉反应。鹦鹉热衣原体通过气溶胶经呼吸道传播，主要引起呼吸道感染和肺炎。肺炎衣原体1989年定名，系严格的人类病原体。生物学性状与其它种衣原体相差较大，碘染色阴性，对磺胺耐药。经飞沫（呼吸道）传播，也可引起院内感染。主要引起青少年急性呼吸道感染，以肺炎多见，也可致气管炎、咽炎。早期研究发现，肺炎衣原体慢性感染可能与冠心病、脑血管意外有关，但最新研究否定这种关联。

微生物学检查标本采集沙眼衣原体

1)眼结膜标本：采集眼结膜拭子/刮片标本，采集后的标本如果在8h内接种，可放置在2～8℃，否则应冰冻在-70℃或以下。

2)尿道及宫颈标本：参见支原体标本采集。

3)盆腔炎患者：无菌穿刺或在腹腔镜直视下采集受累输卵管标本，也可采集子宫内膜刮屑物。

4)LVG患者：可采集淋巴结脓液、直肠拭子和活检。

微生物学检查标本采集鹦鹉热衣原体经典的鹦鹉热患者标本包括痰和血标本。肺炎衣原体鼻、咽拭子或吸液/洗液标本。

以上各种标本在采集后也应置于运输保护液内，如含抗生素的2SP。微生物学检查法

直接涂片镜检

Giemsa、碘液或荧光抗体染色镜检，检查上皮细胞内有无包涵体。用光学显微镜观察包涵体有诊断意义，特别在眼结膜、尿道及子宫颈上皮细胞内发现典型包涵体更有沙眼衣原体感染的参考分离培养

接种鸡胚卵黄囊或传代细胞，再用直接免疫荧光法或酶联免疫法检测。

1.细胞培养将标本拭子，用含抗生素的稀释液制成10％-20％悬液。分离的细胞有McCoy、Hela-229细胞等。置5％CO2下培养。初代分离培养72-96h后传代或盲传。有症状病人90％标本第1代即可见包涵体，而无症状病人需传代后才得到阳性。敏感性为80％-90％，特异性100％，是目前确诊最可靠的方法，而且是评价实验室诊断法的标准。2.鸡胚培养有细菌污染的临床标本加适当的抗生素(如链霉素、庆大霉素和制霉菌素等)肉汤，在室温中作用lh后，接种3-4只孵育7天的鸡胚卵黄囊，35℃孵育，观察至13天，收获卵黄囊涂片，作Gimenez染色，镜检原体。3.鉴定将细胞培养盖片用Giemsa或碘染色镜检胞质内包涵体。Giemsa染色比碘染色敏感，可作为鉴别沙眼衣原体的参考。可用型特异性荧光血清鉴定其型别。对于卵黄囊和小鼠分离的材料可用免疫荧光法鉴定原体或补体结合抗原。

分离培养衣原体培养要求

沙眼衣原体及肺炎衣原体培养可在BSL2级实验室进行，而鹦鹉热衣原体培养则需要在BSL3级实验室进行。

核酸检测

1)核酸杂交：用I125标记的衣原体rDNA探针检测宫颈标本的敏感性和特异性，与培养相比分别为82.8％和99.4％。2)PCR：具有高度敏感性和特异性。一般按沙眼衣原体7．5kb质粒、MOMP序列及SrRNA基因序列设计引物。

PCR

PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR每个循环包含变性、退火、延伸3个步骤，在不到2小时内，经过30个循环，在理论上可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。由于先将标本中的核酸特异成分先行扩增复制再行检出，其敏感性较直接检测核酸大大提高。

目前国内外用于构建引物的衣原体DNA有7.5Kb质粒、MOMP基因（omp1）和16SrRNA基因。诊断试剂盒AMPLICORCtPCR已通过食品和药品管理局(FDA)的审批，其扩增靶序列即为质粒DNA。许多研究都已表明，PCR较培养法和EIA法都要敏感，而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等的研究表明，质粒引物PCR最敏感，omp1引物PCR最不敏感，16SrRNA基因引物PCR介于两者之间。这可解释为在每个衣原体细胞中DNA拷贝数不同的缘故。

PCR

虽然omp1引物PCR敏感性较质粒PCR为差，但omp1引物PCR扩增的特异性好，而且Palmer等报道通过巢式PCR，经过2轮扩增，同样能够达到质粒引物PCR的敏感性。并且omp1扩增后，利用限制性片段长度多态性（RFLP）还可对衣原体进行基因分型，这对流行病学调查具有重要意义。

检测标本常用尿道或宫颈拭子，也可以采用尿液标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。Verkooyen等报道将标本进行预先的加热处理或使用SP转运培养基可显著降低AMPLICORCtPCR对抑制因子的易感性。将临床标本加热处理后10倍稀释亦可在很大程度上防止这种抑制。

注意：尿中的抑制物会降低PCR的敏感性，而出现假阴性结果；污染容易造成假阳性结果。

免疫学检测1.抗原检测a)免疫荧光检查：用荧光抗体检测上皮细胞内衣原体抗原。标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应；而抗MOMP抗体有种、型特异性。可在1h内即作出诊断并可分型。b)酶免疫检测：能在数小时内检测出衣原体可溶性抗原，并适用于同时检测大量标本。c)免疫胶体金检测：双抗体夹心法。在胶体金颗粒或乳胶颗粒表面标记抗衣原体LPS抗体，可与所有衣原体反应。临床实验室最常用的检验方法。

免疫荧光检查涂片冷丙酮或甲醇固定

免疫学检测2.抗体检测目前检测抗体的血清学方法在常规临床诊断中价值较小。原因是不易获得双份血清，而且性传播疾病的高危人群多有慢性重复感染，原有的抗体水平较高，因而限制了血清学方法的诊断价值。方法有补体结合试验(CF)、微量免疫荧光试验(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特异性较差，而MIF敏感性和特异性较高。

标本（链霉素处理）

直接涂片培养核酸检测Mac-Gie-甲碘荧克乳单鸡黄细小核Pchia-msa醛染光隆胶克胚囊胞白酸CVello染色固色标抗吸隆