微生物检验理论课 04药敏试验+合理用药 学习资料

药敏试验规范化操作

及临床合理使用抗菌药物南方医科大学南方医院芮勇宇一、药敏试验规范化操作（一）K-B法药敏试验（二）MIC法药敏试验（三）E-test法药敏试验（四）药敏试验结果解读（一）K-B法药敏试验KB法药敏试验基本原理含有定量抗菌药物的纸片，贴在已接种待检菌的MH平板上，纸片中所含的药物，吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的药物梯度浓度。KB法药敏试验基本原理在纸片周围抑菌浓度范围内，细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小，反映待检菌对测定药物敏感程度；与该药物对待检菌最低抑菌浓度，呈负相关；即抑菌圈愈大，最低抑菌浓度愈小。KB法药敏试验材料准备从冰箱中取出MH平板和药敏纸片，平衡至室温,配制菌悬液的无菌试管，含5ml灭菌生理盐水，无菌拭子，振荡器，0.5麦氏单位硫酸钡标准比浊管，比浊仪，镊子，药敏纸片加样器，游标卡尺或直尺。

KB法药敏试验操作0.5麦氏菌悬液配制，挑取适量细菌于无菌试管中，在管壁研匀，盖好盖后在振荡器上充分混匀，与标准比浊管对比。利用比浊仪，检测菌液浓度，结果更准确。接种MH平板，制备好的菌悬液必须在15分钟内使用。用无菌拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压几次，去掉过多的菌液。用拭子涂布整个MH平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。

用镊子取药敏纸片，贴在MH平板表面，再用镊尖轻压一下，使其贴牢。药敏纸片一旦贴下就不可再挪动。每张纸片间距不少于24毫米，纸片中心距平皿边缘不少于15毫米，直径为90毫米的平板最好贴6张。最好用药敏纸片加样器，贴药敏纸片，以保证纸片贴得均匀。贴好纸片后，须在15分钟内，将平板倒放在35摄氏度孵箱，培养18至24小时。平板最多两块叠放。

KB法药敏试验结果观察从平皿背面观察，最好白炽灯台灯下，黑色无反光背景下，用游标卡尺或直尺量取抑菌环直径，测量抑菌环直径须包括纸片直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量取抑菌环直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。KB法药敏试验质量控制常用标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853,进行室内质量控制，一般一周做一次。常见失控原因质控结果记录错误；量取抑菌环时读数错误；标准菌株被污染或变异；接种的菌悬液浓度不准确；常见失控原因0.5麦氏单位，标准比浊管未摇匀或已过期失效；培养环境不正确；MH平板质量问题；药敏纸片保存温度不当或过期等导致失效。

（二）MIC法药敏试验MIC稀释法一般在琼脂或肉汤中将抗菌药物系列对倍稀释，定量接种待检菌，35℃培养18至24小时后观察结果；抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度；MIC稀释法结果以MIC（μg/ml）数值报告，数值越小越敏感，与K-B法相反；MIC稀释法药敏检测BDPhoenix100细菌自动鉴定及药敏分析仪MIC稀释法药敏鉴定孔生化试验细菌鉴定孔（三）E-test法药敏试验E-test药敏检测结合K-B法和稀释法的优点；原理同稀释法检测，操作同K-B法简单；试纸条上含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的某种抗菌药物。

E-test药敏检测替加环素MICTestStrip从2~8℃冰箱中取出琼脂平板（江门市凯林贸易公司）。从—20℃冰箱中取出MTS测试条（替加环素MICTestStrip，0.016~256μg/ml，意大利liofilchem公司），美国辉瑞公司惠赠。平衡至室温，半小时至1小时。（四）药敏试验结果解读临床和实验室标准化委员会标准（clinicalandlaboratorystandardsofinstitute,CLSI）敏感（susceptible，S）是指菌株能被使用推荐剂量治疗感染部位可达到的抗菌药物浓度所抑制，推荐使用；中介（intermediate，I）指抗菌药物MIC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌株。还表示药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类），或者可用高于正常剂量的药物进行治疗（如β-内酰胺类）。另外，中介还作为缓冲区，以防止微小的、未受控制的技术因素导致较大的错误结果，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。耐药（resistant，R）指菌株不能被常规剂量抗菌药物达到的浓度所抑制，和/或证明MIC或抑菌圈直径落在某些特殊的微生物耐药机制范围（如β-内酰胺酶），在治疗研究中表现抗菌药物对菌株的临床疗效不可靠。抗菌药物的作用靶位

耐甲氧西林葡萄球菌（methecillinresistancestaphylococcus，MRS）

CLSI规定，葡萄球菌如对苯唑西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果。

产超广谱β-内酰胺酶G-杆菌(extendedspectrumβ-lactamaseG-bacillus，ESBLs)

该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类的超广谱β-酶，主要由肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌、肠杆菌等细菌产生。

耐高浓度庆大霉素肠球菌（HighlevelaminoglycosidesresistanceinEnterococcus）

CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常联合应用β-内酰胺类和氨基糖肽类抗生素，如果肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。

耐万古霉素肠球菌（VRE）再用E-test法验证；如发现VRE，则应注意对相应病人做好隔离，以防医院感染扩散。

肺炎链球菌耐青霉素（PRSP）用本唑西林纸片监测；如耐药表明对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢克肟、头孢唑肟疗效很差。二、临床合理使用抗菌药物（一）CLSIM100-S22药敏试验解读（二）临床常用抗菌药物种类及合理使用（三）PK/PD参数与抗菌药物合理使用（一）CLSIM100-S22药敏试验解读（二）临床常用抗菌药物种类及合理使用氨基糖甙类：阿米卡星Amikacin、庆大霉素Gentamicin1代头孢：头孢唑啉Cefazolin2代头孢：头孢呋辛钠Cefuroximesodium3代头孢：头孢他啶Ceftazidime、头孢噻肟Cefotaxime4代头孢：头孢吡肟（马斯平）Cefepime细菌药敏试验中常选抗菌药物种类单环β-内酰胺类：氨曲南Aztreonam广谱青霉素类：氨苄西林Ampicilin、青霉素GPenicillin、苯唑西林Oxacillin

抗假单胞菌广谱青霉素：哌拉西林Piperacillin复方β-内酰胺类：阿莫西林-克拉维酸（奥格门丁）Amoxicilin/clavelanate、氨苄西林-舒巴坦（优力新）Ampicillin/Sulbactam、哌拉西林-他唑巴坦（特治星）Piperacillin/Tazobactam、头孢哌酮-舒巴坦（舒普深）cefoperazone/Sulbactam碳青霉烯类：亚胺培南Imipenem、美罗培南Meropenem多肽类：多粘菌素EColistinE、替考拉宁Teicoplanin、万古霉素Vancomicin磺胺类：复方新诺明（甲氧苄唑-磺胺甲唑）Timethoprim/Sulfamethoxazole林可霉素类：克林霉素Clindamycin大环内脂类：红霉素Erythromycin氯霉素：氯霉素Chloramphenicol三代喹诺酮：环丙沙星Ciprofloxaxin

、氧氟沙星Ofloxaxin

、左旋氧氟沙星Levofloxacin

、莫西沙星Moxifloxacin四环素类：四环素Tetracycline利福平Rifampin

（三）PK/PD参数与抗菌药物合理使用PK/PD简介机体对药物的作用属于药物动力学（pharmacokineties，PK），PK主要研究药物在体内量经时变化的规律，用数学模型来阐明药物在体内的分布、数量（或浓度）与时间的关。PK/PD简介药物对机体（含病原体）的作用属于药效学（pharmacodynamics，PD），PD主要研究药物效应随着给药时间和浓度而变化的动力学过程。PK/PD简介PK/PD研究是把PK与PD结合起来研究药物剂量相对应的时间-浓度-效应关系，可以反映药物-人体-病原体之间的关系。时间依赖性抗菌药物(timedependenceantimicrobialagents，简称TDAA)。浓度依赖性抗菌药物(antimicrobialdrugconcentrationdependence，简称ADCD)。PK/PD简介PK/PD的主要参数有：⑴t>MIC，即血药浓度大于的持续时间；⑵Cmax/MIC，即抗菌药物血药峰浓度（Cmax）与的比值；⑶AUC/MIC，即药时曲线下面积（AUC）与MIC的比值。PK/PD简介时间依赖性抗菌药物（小火慢炖）指药物浓度超过MIC的4-5倍以上时，其杀菌活力不再增加，达到了饱和状态的一类药物。反映这类药物杀菌活性的PK/PD参数为t>MIC，即血药浓度达到或超过MIC持续的时间，有时也用t>MIC

占2次给药间隔的百分比来表示。包括β-内酰胺类、大环内酯类、糖肽类和克林霉素等。浓度依赖性抗菌药物，指杀菌活力在很大范围内随药物浓度的增大而增加的一类药物。反映浓度依赖性药物的杀菌活性的PK/PD参数为Cmax/MIC或AUC24/MIC。其特点是具有较长的PAE和首剂接触效应（thefirst-exposureeffect，FEE）。包括氨基糖苷类、喹诺酮类和甲硝唑等。浓度依赖性抗菌药物（大火爆炒）