秋水仙素诱导秋海棠多倍体技术规程（征求意见稿）

1T/AHAASSXXX—XXXX秋水仙素诱导秋海棠多倍体技术规程本文件规定了秋海棠（BegoniagrandisDryand.）愈伤组织的诱导培养、秋水仙素化学诱变的仪器设备、秋水仙素处理液的配制、秋水仙素诱变处理秋海棠愈伤方法、秋水仙素诱变处理后愈伤组织芽分化、壮苗与生根、移栽与定植、秋水仙素诱变后植株筛选与鉴定。本文件适用于采用秋水仙素对秋海棠愈伤组织进行化学诱变、创新秋海棠种质。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5084农田灌溉水质标准GB/T6001育苗技术规程GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则JB/T10594日光温室和塑料大棚结构与性能要求NY/T496肥料合理使用准则通则NY/T2118蔬菜育苗基质NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程LY/T1770桉树无性系组培快繁技术规程LY/T1882林木组织培养育苗技术规程LY/T2234林业机械林业工厂化育苗育苗穴盘3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1秋海棠秋海棠科、秋海棠属多年生草本植物。根状茎近球形，茎直立，高可达60cm，有纵棱无毛。茎生叶互生，叶片轮廓宽卵形至卵形两侧不相等，上面褐绿色，常有红晕，下面色淡，带紫红色，托叶长圆形至披针形膜质，花葶有纵棱，无毛；花较多数粉红色，花形多姿，叶色柔媚，苞片长圆形，先端钝，早落；花药倒卵球形，子房长圆形，蒴果下垂，轮廓长圆形，种子长圆形小，淡褐色数极多，7月开花，8月开始结果。T/AHAASSXXX—XXXX23.2秋水仙素又名秋水仙碱，是一种生物碱，化学式为C22H25NO6，为淡黄色结晶性粉末，秋水仙碱能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期，因而使染色体加倍。3.3愈伤组织植物组织在受到损伤后，通过细胞分裂和分化形成的一团未分化的细胞集合体，具有较强的再生能3.4化学诱变用化学诱变剂秋水仙素处理植物材料，以诱发遗传物质的突变，从而引起植株形态特征的变异。3.5多倍体染色体组数为基本染色体组数2倍以上的植物个体。3.6突变体由于基因突变而表现出突变性状的个体。4基本要求4.1环境条件4.1.1组培工厂选址排灌水方便，远离污染源，水电供应充足，交通便利，周边环境清洁，地下水位在1.5m以下，一般建在城市的近郊区。4.1.2大棚选址应选择交通方便，地势高，排水良好，通风性好，周围没有高大建筑物，两侧没有高大的防风林带的位置。4.1.3灌溉水应符合GB5084对水质的要求。4.2肥料肥料使用遵守NY/T496的规定。4.3设施T/AHAASSXXX—XXXX34.3.1组培室设置组培室通常包括洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、储藏室等。4.3.2大棚玻璃温室（大棚或联栋）或日光温室设施的结构与性能应符合JB/T10594的规定。要求设施坚固，抗灾能力强，并且具备一定的环境调控能力，能够调节温度、湿度、光照以及防虫防雨等。4.3.3其它设备应配备天平、分析天平、纯水仪、超净工作台、接种器具消毒器、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、移液枪、恒温摇床、光照培养箱、流式细胞仪、105孔育苗穴盘、育苗基质、苗床（宜采用可移动苗床）、风机、遮阳网、肥料机、光照用灯具、温度计、湿度计、pH值检测仪、EC值检测仪、种苗周转箱等设备。5秋海棠愈伤组织诱导培养5.1母液配制MS基本培养基的组分及含量参见附录A.1。MS、6-BA、NAA等母液配制参照NY/T2306执行。5.2培养基参见附录A，表A.2。灭菌和存放按照LY/T1770和LY/T1882相关条款执行。5.3外植体选择与消毒取嫩叶，用0.1%的洗衣粉液洗涤后，再用蒸馏水清洗干净，放置于超净工作台上进行消毒处理。具体消毒操作步骤是：先用无菌水清洗1遍，然后倒入含有1滴tween-20的30%的84消毒液消毒8min，倒掉84消毒液，用灭菌水漂洗5次～8次，直至澄清无异味备用。5.4培养条件本研究采用的培养基中含有25g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH=5.8，培养室温度（24±2）℃,光照2000Lx～3000Lx，每天光照16h，黑暗8h，培养室相对空气湿度70%。5.5愈伤诱导培养在超净工作台上将消毒、灭菌好的外植体叶片切成约1cm2大小，叶正面朝上接种到配制好的培养基上，25d诱导叶片长出翠绿的愈伤。6秋水仙素处理液的配制T/AHAASSXXX—XXXX4通过前期研究发现秋水仙素处理后秋海棠愈伤半致死剂量为0.05%（质量分数）秋水仙素，因此称取0.05质量分数）秋水仙素，用纯水溶解，并定容至1000mL，过滤除菌备用。7秋水仙素处理秋海棠愈伤7.1芽分化培养基参见附录A，表A.2。7.2培养条件见5.4。7.3操作要求在超净工作台内将愈伤组织接入己除菌的秋水仙素溶液中浸泡，浸泡处理时间设置4h，避光、置于摇床每分钟70转，待浸泡时间结束后将愈伤组织取出，用灭菌水漂洗5遍，滤纸吸干表面水分，再移入分化培养基中，每个培养瓶放置4块愈伤，观察并记录，40d后分化出部分小芽。8壮苗培养8.1壮苗培养基参见附录A，表A.2。8.2培养室条件见5.4。8.3操作要求培养40d左右，待芽长至0.5cm～1.0cm高，用手术刀切除基部大部分愈伤，团块转移，原则将同一块愈伤分化出的芽转入同一培养瓶中，作为同一个株系。培养20d～25d，苗高2.0cm以上，壮苗完成。9生根培养9.1生根培养基参见附录A，表A.2。9.2培养条件T/AHAASSXXX—XXXX5见5.4。9.3操作要求将壮苗后的小苗单株接种到9.1的培养基中培养30d～35d左右，长出很多须根，做好标记。10炼苗和移栽10.1炼苗根系发育良好、根系长0.5cm～1.5cm的瓶苗，连瓶子一起置于大棚内的环境中炼苗，炼苗5d~7d后揭开瓶盖，继续炼苗3d～5d。10.2基质配方育苗基质应符合NY/T2118的要求，宜采用泥炭、珍珠岩和蛭石的体积比配制，用泥炭、珍珠岩和蛭石配制，其比例为10:4:3。宜采用无菌含大量有机物的基质，泥炭粗细度宜不高于10mm，pH值宜控制在5.5～6.5之间，蛭石片径不高于3mm，珍珠岩宜采用2mm～4mm粒径。手感松软，无霉变和结块。10.3基质消毒用25%的多菌灵可湿性粉剂500倍液喷施基质，堆积7d以上再装盘。10.4洗苗与移植将炼苗后的组培幼苗连同培养基一同取出，放在清水中轻轻振动，漂洗干净幼苗根上的培养基，再将幼苗移植于105孔穴盘中（穴盘质量应符合LY/T2234的要求并做好标记，以瓶为株系编号1-1，1-2……11苗期管理11.1在温室大棚内苗床上培育幼苗a)湿度保持90%以上，每天宜轻雾喷洒水，每天通风2h；b)当新叶长出来时，湿度宜逐渐降低至80%左右，但不能使植株干透，这时可以薄施肥，用复合肥（N-P2O5-K2O=15-15-15）水溶液稀释2000倍淋施，每隔7d～10d喷施一次；c)维持25±1℃的最佳生长温度，保证植株生长速度；d)幼苗期光照强度高于8000Lx时使用遮阳网。11.235d左右植株进入大苗期管理T/AHAASSXXX—XXXX6a)加大干湿循环，干则干透，浇则浇透的浇水原则（干透的标准盘重宜控制在1.0kg左右，浇透的标准盘重宜控制在2.2kg左右）；b)加大通风，增加光照（风机每天宜开机2h～4h，光照维持在8000Lx～12000Lx，生长温度宜控制在23℃~26℃);c)大约每5d～10d施肥一次，采用氮-磷-钾均衡为20-20-20的水溶肥，稀释1600～2000倍；d)每次施肥后宜喷洒一次1500倍的含嘧菌酯的杀菌剂，同时喷洒预防蚜虫和青虫的农药（参照附录A，表A3）。11.320d左右进入炼苗期管理温度白天宜控制在（25±1）℃,夜晚宜控制在（16±1）℃,温差宜控制在（10±1）℃。湿度宜控制在70%以下，光照强度宜控制在20000Lx～25000Lx。农药喷洒参照大苗期。炼苗5d～7d，准备出圃。12上盆定植12.1基质配方采用园土20%、草炭60%、珍珠岩20%混合均匀。12.2基质装盆的要求选择口径为14cm的塑料盆，基质装盆即把基质灌到花盆中，装盆时要求基质装满到离盆口1cm~1.5cm左右。12.3上盆植苗的方法植苗时先用小铲挖一小穴，然后把种苗放入后回土稍按紧，所挖穴的大小应比穴盘的穴孔大些，深度应以放入穴盘苗后穴盘苗原来的基质面与覆土后的基质面相平或稍低一些，避免把苗硬按在基质里或把根系露在外面，前者会造成小苗的根系挤压在基质里而逐渐坏死，后者由于根系露在外面造成根毛干枯。上盆后应及时浇水，基质很干或在夏天可以浇透（即浇到看见盆底漏水为止冬季只浇到根系以下2cm以上的基质充分湿润就可，特别是对大容器栽植小苗而言，更应注意浇水，否则基质不容易干难以施肥。上盆后应及时做好标签插牌工作，标示上盆日期、品种名称、品种编号。13栽培管理措施13.1浇水T/AHAASSXXX—XXXX7浇水的频率视天气情况而定，在安徽一般夏天（除了阴雨天）几乎每天都需浇一次水，春秋2d～3d浇一次，冬季5d～6d浇一次。决定是否需要浇水应在前天的下午3点左右检查基质的干湿情况，此时从基质表面看上去有点发白第二天应浇水。还可从植株叶片的颜色判断是否应浇水，如基质干，叶片颜色就变淡，干的厉害的叶片发白，此种情况应浇水。13.2施肥13.2.1施肥配方参见附录A，表A.4。13.2.2施肥操作要求上盆后注意缓苗期管理，度过缓苗期后4d～10d（新根已长出2cm以上）即可进行第一次追肥，小苗前期可用N、P、K复合肥，N、P、K比例在30:10:15，氮肥浓度在150ppm～200ppm（约稀释800～1000倍），对盆土施肥浓度过高容易造成烧苗，以后每隔7d～10d追施一次。苗后期到发芽分化期N、P、K比例在20:10:20，氮肥浓度可增加到250ppm～300ppm,（约稀释500～800倍），花芽分化期可逐渐增加P、K肥的比例，N、P、K比例在15:20:25以促进花芽分化，达到多开花、花朵大、花色艳、花期长，提高“花盖度”（即花朵或花序数量占冠幅面积的百分数）。13.3病虫害管理13.3.1药物使用严格按照GB/T8321的规定执行。13.3.2病虫害防治方法见附录A，表A.3。13.3.3病虫害日常管理在冬春季和梅雨季节以防病为主，其中病害防治又以预防炭疽病、灰霉病、叶斑病为主，猝倒病主要在栽培基质配置时尽量不要使用未消毒的旧介质，平常温室管理中加强死苗病苗的及时清理。灰霉病预防主要是加强通风，降低湿度。虫害上容易发生斑潜蝇的危害，特别是早春，夏秋季重点预防叶斑病、猝倒病为主，加强虫害的监控和防治，特别需要加强鳞翅目夜蛾科类、白粉虱、蚜虫、螨类害虫的防治，根据病虫害发生的规律，最好每隔7d～10d喷一次杀菌剂和杀虫剂，以预防为先，否则，一旦病害大规模发生，特别是细菌性叶斑病，难以防治，将会产生较大损失。环境卫生的管理也是预防病虫害发生的一个重要方面，在生产过程中，不仅要及时除去容器中和温室周边的杂草，还要及时清理病株死株，防止病菌的蔓延。T/AHAASSXXX—XXXX8喷药时间5月～9月份选在傍晚4点～8点，早上5点～8点也可，但由于早上要浇水，而喷药后至少要一小时后才能浇水，所以喷药常在傍晚；10月～11月份或3月～4月份喷药在2点～4点；12月～2月份在10点～2点比较好。喷药应对着叶片的正反面喷，走速要均匀，喷药量以叶片正反面都均匀覆有药液，特别是植株下部叶片，但不成滴水状为宜。14秋水仙素诱变植株的筛选与鉴定14.1多倍体植株的初步筛选利用外部形态学进行初步鉴定，植株生长期间以野生型为对照，染色体加倍植株外部形态可能表现以下特征：叶片较宽、较大或有皱褶、叶片变厚变脆、叶片颜色更绿、茎较粗壮，节间变短；花冠明显变大；生长缓慢等特征。根据上述标志，即可把没有多倍体特征的材料及时淘汰，对初步认为是多倍体的材料进行观察、记录、拍照、挂牌标记按单株编号，再做进一步检查。14.2多倍体鉴定方法14.2.1气孔鉴定观察气孔和气孔保卫细胞的大小是较为可靠的鉴定多倍体的解剖学方法。撕取最外层叶片的下表皮进行制片，在显微镜下观察气孔，据研究，秋海棠四倍体保卫细胞长度都比二倍体增加44%以上，秋海棠四倍体保卫细胞宽度都比二倍体增加45%以上。14.2.2秋海棠染色体倍性鉴定秋海棠染色体倍性鉴定采用流式细胞仪法，检测快、采集数据量大等优点。解离液配制采用Kiwifruitbuffer缓冲液解离液制备叶片细胞核悬液10mmol·L⁻¹MgSO4·7H2O，50mmol·L⁻¹KCl，3.5mmol·L⁻¹HEPES，0.3%(V/V)TritonX-100，1%PVP-30，最终定容至100mL，用NaOH溶液调制pH7.5备用。细胞悬浮液提取方法a)取0.1g嫩叶片，滴加2mL解离液,快速切碎至糊状。b)过滤处理，切好的材料分别用400目滤膜过滤到2mL的离心管中，紧接着加入解离液至1.5mL，然后置于4℃冰箱中5min。c)取出解离液，置于离心机内，4℃离心1000r·min⁻¹,5min，离心后弃上清液，加入600µL解离液与60µL预冷PI染色液，置于4℃冰箱中避光染色15min。d)利用流式细胞仪检测，将样品移至上样管上机检测，仪器将实验数据传入电脑中。T/AHAASSXXX—XXXX915突变植株培育经过气孔和倍性鉴定将得到的多倍体突变植株，对其进一步培育，在倍性变异后表现优良经济性状的植株，可作为育种材料，种在选种圃，进行全面鉴定