2.2动物细胞工程-二动物细胞融合技术和单克隆抗体课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

二

动物细胞融合技术和单克隆抗体【本节聚焦】1.什么是动物细胞融合技术？2.单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？第2节

动物细胞工程复习提问1．动物细胞工程常用技术包括哪些？什么是动物细胞培养？

基本原理是什么？2.动物细胞培养需要哪些条件？3.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？4.动物细胞培养大致过程是什么？植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养

植物体细胞杂交技术可以跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，培育出新的作物类型。那么，有没有技术让不同种动物的体细胞进行杂交，培育出集不同细胞的优势于一身的动物细胞呢？知识回顾：必修一第三章第1节现在学习：什么是细胞融合？人细胞和小鼠细胞如何融合在一起的呢？以前学习：这一实验以及相关的其他实验证据表明，细胞膜具有流动性。如何让两个不同的来源动物细胞融合为杂种细胞？合作探究一：请同学们自主阅读教材P48，小组合作思考讨论完成问题。

1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果分别是什么？2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些？4.动物细胞融合技术有何意义？在现实生活中的应用有哪些？3.什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理？融合实质及完成的标志？（教材P48的相关信息）一、动物细胞融合技术思考（P49）：19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象？病人体内的病毒诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。灭活病毒诱导法肺结核病人病理切片一、动物细胞融合技术病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合1.“灭活病毒”中灭活的具体含义是什么？2.灭活病毒诱导细胞融合的原理是什么？细胞核的融合融合完成的标志：某种病毒紫外线灭活丧失感染活性(不感染细胞)保留抗原结构(诱导细胞融合)一、动物细胞融合技术1.概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2.原理：细胞膜具有一定的流动性3.结果：形成杂交细胞4.诱导方法：与植物原生质体融合的方法相同物理法电融合法等化学法聚乙二醇（PEG）融合法生物法灭活病毒诱导法动物细胞融合特有细胞核的融合→具有原来两个或多个细胞的遗传信息。6.

意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。至今，种间、属间、科间、甚至动物和植物之间的细胞融合都已获得了成功。5.融合实质及完成的标志：一、动物细胞融合技术植物体细胞杂交动物细胞融合原理步骤诱导方法结果意义细胞膜的流动性、植物细胞的全能性细胞膜的流动性酶解法去壁→诱导原生质体融合→再生新壁形成杂种细胞→植物组织培养→杂种植株诱导细胞融合PEG融合法、电融合法、灭活病毒形成杂种植株形成杂种细胞克服远缘杂交不亲和障碍聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2＋—高pH融合法、电融合法、离心法比较：…….由血清中提取的抗体是由不同浆细胞产生的多种抗体的混合物，可达百万种以上。…….每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体抗体1抗原1B细胞1刺激抗体2抗体3抗体4抗原2抗原3抗原4B细胞2B细胞3B细胞4刺激刺激刺激产量低、特异性差需要获得获得大量的B细胞1问题:若我们只需要大量抗体1，有什么办法吗？(2)缺陷:纯度低、向动物体内反复注射某种抗原(1)方法:早期获得抗体的方法及缺陷每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体单一B淋巴细胞单一B淋巴细胞群选择克隆产生大量纯度高特异性强的抗体（单克隆抗体）克隆单一的B淋巴细胞，形成B淋巴细胞群，由细胞群产生大量的纯度高的抗体一个正常的B淋巴细胞不可能无限增殖的。怎样才能使B细胞在产生抗体的同时，具备无限增殖能力呢？大量制备单一抗体的思路：单个细胞无性繁殖化学性质单一，特异性强单：克隆：抗体：二

单克隆抗体及其应用动物细胞融合动物细胞培养单克隆抗体【资料3】1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上，充分发挥想象力，设计了一个极富创造性的实验方案：一种B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体）骨髓瘤细胞（癌细胞）能在体外无限增殖杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体二

单克隆抗体及其应用合作探究二：请同学们自主阅读教材P48-49，小组合作思考讨论完成问题。

3.会有几种细胞融合方式？杂交瘤细胞具有什么特点？1.单克隆抗体制备过程中为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白？4.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体？2.产生特定抗体的杂交瘤细胞的获得需要几次筛选？各自筛选的方法和目的是什么？二

单克隆抗体及其应用用特定抗原免疫小鼠，并培养骨髓瘤细胞多种B细胞骨髓瘤细胞诱导融合从小鼠脾中获得产生特定抗体的B细胞动物细胞融合技术二

单克隆抗体及其应用用特定抗原免疫小鼠，并培养骨髓瘤细胞多种B细胞骨髓瘤细胞诱导融合杂交瘤细胞筛选第一次筛选：方法：结果：用特定的选择培养基筛选未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长二

单克隆抗体及其应用第一次筛选------获得杂交瘤细胞【资料】细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。

筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基喋呤（HAT选择培养基）B淋巴细胞合成DNAS途径D途径不能无限分裂增殖骨髓瘤细胞合成DNAD途径能无限增殖B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能合成DNA，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长B1-瘤B2-瘤B3-瘤…….用特定抗原免疫小鼠，并培养骨髓瘤细胞多种B细胞骨髓瘤细胞诱导融合杂交瘤细胞产生特定抗体的杂交瘤细胞筛选筛选第二次筛选：方法：原理：结果：抗原—抗体杂交获得抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞二

单克隆抗体及其应用抗原—抗体特异性结合第二次筛选---获得分泌专一抗体的杂交瘤细胞用培养液

稀释培养杂交瘤细胞(多种)抗体检测呈

阳性的杂交瘤细胞

多孔细胞培养板阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。约每孔1个进行培养（克隆化培养）标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）单克隆抗体制备过程中两次筛选的比较项目第一次筛选第二次筛选筛选原因目的

筛选方法

筛选出杂交瘤细胞筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞用特定的选择培养基（HAT培养基）筛选：未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。克隆培养、抗体检测：用多孔细胞培养板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。诱导融合后得到的细胞中，除杂交瘤细胞之外，还有未融合的亲本细胞，也有融合的具有同种核的细胞用特定抗原免疫小鼠，并培养骨髓瘤细胞多种B细胞骨髓瘤细胞诱导融合杂交瘤细胞产生特定抗体的杂交瘤细胞单克隆抗体筛选筛选培养、提取体外培养：体内培养：动物细胞培养技术→从细胞培养液提取注射到小鼠腹腔增殖→从小鼠腹水中提取二

单克隆抗体及其应用脾中产生多种B淋巴细胞提取（产生特定抗体）给小鼠注射特定抗原培养小鼠骨髓瘤细胞（能无限增殖）骨髓瘤细胞诱导融合多种细胞第一次筛选特定的选择性培养基只有融合的杂交瘤细胞克隆化培养、抗体检测第二次筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞体外培养注射到小鼠腹腔大量单克隆抗体腹水培养液特异性强灵敏度高可大量制备B细胞B-B细胞杂交瘤细胞瘤细胞瘤-瘤细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术二

单克隆抗体及其应用小结：【拓展】

抗体的人源化

利用小鼠获得的单克隆抗体，能直接用于人体吗？为什么？不能，单克隆抗体会被人体当做抗原，发生免疫反应。将非人源（如鼠源）抗体的关键功能区域移植到人类抗体框架中，以降低免疫原性并提高治疗效果。抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体1.作为诊断试剂——最广泛的应用资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的“早早孕诊断试剂盒”。在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10d左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。三

单克隆抗体的应用原理：抗原和抗体能够特异性结合甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为______免疫小鼠，制备____________________，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的______会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在______上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤结合同位素的单抗荧光标记的单抗三

单克隆抗体的应用1.作为诊断试剂——最广泛的应用艾滋病检测试剂新冠病毒抗原检测试剂盒如何鉴定血型？细胞凋亡①ADC被细胞吞噬②⑤ADC抗体药物接头2.用于运载药物资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物(如细胞毒素)三部分组成，它的作用机制如下图：单克隆抗体+药物=“生物导弹”将连接的药物输送到靶细胞发挥治疗效应三

单克隆抗体的应用肿瘤细胞讨论2.除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。讨论3.单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？①

单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒；②

ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。脂质体给药高效

低毒

靶向抗肿瘤药物载体：阿霉素脂质体和顺铂脂质体已在国外上市。三

单克隆抗体的应用单克隆抗体单独使用，也可直接用于治疗疾病如果被毒蛇咬伤，如何快速治疗？抗毒血清的主要作用成分是相应的抗体三

单克隆抗体的应用3.作为药物治疗疾病单克隆抗体制备过程相关知识点检测（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理____________________________________________________（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量增殖，又能产生抗体（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选________________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即__________________________________（8）抗体检测原理_______________________________________（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点_____________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳单克隆抗体制备过程相关知识点检测小结原理：方法：动物细胞融合技术细胞膜具有流动性物理法、化学法、生物法单克隆抗体获取已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞→融合、筛选→产生特定抗体的杂交瘤细胞→体外或体内培养→提取单克隆抗体制备：应用：诊断试剂;治疗疾病;运载药物一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（

）A.它们的原理