泻白散论文主题：HPLC;祛痰作用;抗炎作用;谱效关系

1泻白散，来源于《小儿药证直诀》,其具有清泻肺热、平喘止咳的功用，本研究主旨在探讨泻白散的谱效关系，确定其有效成分及部位。1、建立了泻白散高效液相指纹图谱分析方法，标定了色谱图中的12个峰，并对其中11个峰进行了归属。结果表明11个色谱峰中，1、2、3、4、5、10号峰为桑白皮的峰，6、7、8、9、11号峰为甘草的峰，色谱图中没有归属到地骨皮的相关峰。同时，确定了样品的贮存方式以保证样品的稳定性，试验结果表明该样品不能以溶液的形式贮存，而应该以粉末的形式贮存。以溶液方式贮存，样品在6h内迅速新生成了一个峰，并且记录其11个峰的峰面积，其RSD值最大可到49.1%;以粉末形式贮存，样品在72h内稳定，RSD值小于5%,因此决定采用以粉末形式贮存，实验时即溶即用。2、采用相关分析和回归分析对泻白散的谱效关系进行了研究。本文采用正交试验设计，共得9个处方。首先分别采用小鼠抗炎(二甲苯致小鼠耳肿胀法)和小鼠祛痰(小鼠气管酚红法)对其进行祛痰和抗炎的药效实验，同时进行HPLC图谱研究，将所得药理数据和各色谱峰面积相关联，探讨复方中药泻白散的谱效关系。相关性分析结果表明在12个色谱峰中有5个与药理数据密切相关的色谱峰与祛痰和抗炎作用呈正相关，其均来自于桑白皮。回归分析结果表明在12个色谱峰中有8个与药理数据密切相关的色谱峰被引入回归方程。它们依次为2、5、6、7、8、9、10、12号峰所代表的化学成分。其中2、5、10号峰来自于桑白皮，6、7、8、9号峰来自于甘草。综合回归分析和相关性分析结果，确定与泻白散祛痰和抗炎作用密切相关的为2号峰和5号峰所代表的化学成分，其均来自于桑白皮。通过对其在紫外190-380nm下扫描可得其在290nm和325nm处有最大紫外吸收，通过对比文献，判定其为二苯乙烯苷类成分。关键词：泻白散；HPLC;祛痰作用；抗炎作用；谱效关系2omXiaoErZhiZhfclearinglung,antitussiveandantiasthmatic.Inmyexperimentsthechrstoredinformofpowder.Storedinsolution,theh.andRSDvaluesof11peakswhichrecordedinHPLCweremaximumto49.13%;Thechromatographicpharmacodynamicsofxie-baipowdercorrelationanalysisandregressioactionandexpectorantactionwerestudiedbytheL₉(3⁴)orthogonaldesign,arrange9combinations,3leversperformanceliquidchromatographswerealsostudiedbysameorthogoofCorrelationanalysisshowwithanti-inflammatoryanderegressionequation,whichwerepeak2,5,6,7,8,9,10,12.Amongofthem,PefromCortexMoriandpeak6,7,8,9,12werefromRadixetRh290nmand325nm.Bycomparingtheliterature,thetwochemica3t4中药复方制剂是中医药的精髓和主流。中药复方的功效已为几千年的历史和现代临床疗效所肯定。但如何采用现代科学技术手段来说明中药作用的本质、作用机理、中药药性理论等丰富内涵，使中药复方能为国际市场所能接受，目前尚有一段差距。从中医的观点来看，中药的功效是物质群的整体作用结果，而黄连素和黄连、甘草酸和甘草、人参皂苷和人参是不能等同的，因此对指标成分的控制难以真正控制中药的药效，要控制中药药效，不能只针对某一、二个化学成分，必须对方剂物质整体予以控制。现代物质群指纹图谱技术，展现了这种可能性。系统分析中药复方的化学成分，阐明有效部位或有效成分的种类，建立全面反映其成分的指纹图谱，将更加有效体现中药复方成分的整体性和综合作用，更好地评价中药复方的质量。因此，只有将标示物质群特征峰的中药指纹图谱与功效结果相对应起来，将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中和药效评价标准提供规律性的科学依据，从而建立中药产品与其疗效基本一致的反映产品内在质量的质量标准，真正对我国中医药现代化、国际化起到积极的促进作用。目前对中药谱效关系的研究还停留在很初步的阶段。传统中药名方“泻白散”出自《小儿药证直诀》,由桑白皮、地骨皮、甘草三味药材组成，锉散后，入粳米一撮，水煎服。有泻肺清热，止咳平喘之功。泻白散尚无质量控制指标，也并无与复方配伍相关的化学研究及药理药效研究的报道，本文应用中药指纹图谱的方法来阐明泻白散的药效成分，试图通过谱效关系的研究来确定有效部位或有效成分，为进一步进行泻白散质量控制研究奠定基础。1、泻白散的HPLC图谱的研究，并通过组方中单味药物的HPLC图谱研究对复方2、采用小鼠酚红法和小鼠耳肿胀法对泻白散祛痰作用和抗炎作用进行研究；采用相关性分析和回归分析研究泻白散的谱效关系，确定有效成分及有效部位。沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究5泻白散，来源于《小儿药证直诀》,由桑白皮15g、地骨皮15g、甘草3g三味药材组成，锉散后，入粳米一撮，水煎服，其具有清泻肺热、平喘止咳的功用，主治肺有伏火郁热之证。肺主西方，属金，其色应白，“泻白”,故泻肺也。而仍云泻者，有平肺之功”。方中桑白皮主入肺经，倾泻肺热，平喘止咳，为君药。地骨皮甘寒入肺，可助君药泻肺中伏火，且有养阴之功，君臣相合，清泻肺火，以复肺气之肃降。王子接《降雪园古方选注》卷中：“肺气本辛，以辛泻之，遂其欲也。遂其欲当谓之补，而仍云泻者，有平肺之功焉。桑皮、甘草，其气俱薄，不燥不刚，虽泻而不伤于娇脏。《经》言：肺苦气上逆，急食苦以泄之，故复以地骨皮之苦，泄阴火，退虚热，而平肺气。使以粳米、甘草，缓桑、骨二皮于上，以清肺定喘。”本方之特点是清中有润、泻中有补，既不是清透肺中实热以治其标，也不是滋阴润肺以治其本，而是清生理特点亦甚吻合。桑白皮为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥根皮。甘、寒，归肺经，泻肺平喘，利水消肿，可用于废热喘咳，水肿胀满尿少，面目肌肤浮肿1]。主产于安徽、河南、浙“去肺中水气，唾血，热渴，水肿腹胪胀，利水道。”《药性论》中载：“治肺气喘中有水气及肺火有余者宜之。”南北朝刘宋《雷公炮炙论》认为桑白皮在中药中有独特效用，“是它药不替也”;《中国药典》载：桑白皮性寒味甘，归肺经，用于肺热咳喘、水肿胀满鸟少及面目肌肤浮肿等症。目前临床上用于治疗水肿、胸膜炎、百日咳、小儿流涎、糖尿病、气管炎及鼻衄等。地骨皮为茄科植物枸杞LyciumchinenseMill和宁夏枸杞L.barbarumL.的根皮，性6寒，味甘、淡，归肺、肝、肾经，凉血除蒸，清肺降火。用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、肺热咳嗽、咯血、衄血。分布于我国南北各地。其源于《本经》,《本经》中载“主五内邪它列为上品。陶弘景云“此草最为众药之主，经方少而不用者，犹如香中有沉香也，国药中甘草为君，治疗七十二种乳石毒，解一千二百余种草木毒，调和众药有功，故有国使之不争，故热药得之缓其热，寒药得之缓其寒，寒热相杂者，用之得其平”。甘草能称，解百毒的作用。2泻白散化学成分研究概况2.1桑白皮桑白皮主要含有黄酮类化合物、二苯乙烯类化合物、芳香苯骈呋喃衍生物，香豆素类化合物、N糖类、甾体类等多种成分。黄酮类化合物l2-2]桑酮(kuwanon)A-Z²-7、桑酮醇(kuwanol)A-EL²-8、桑根酮sangenon(A-T)⁹3、桑根酮醇sangen(A-0)091416、桑根呋喃sanggenofuranA⁶、芳香苯骈呋喃类化合物桑色呋喃mullberrofuran(A-Z)⁵,162324等.香豆素类化合物5,7-羟基香豆素(5,7-dihydroxycoumarin)、伞形花内酯 (Umbelliferone)、东莨宕素(scopoletin)、skimming、东莨宕内酯(6-甲氧基-7-羟基-聚糖[29]。此外还有N糖类27如1-deoxyno甾醇28、3β-[(m-methoxybenzoyloxy)Jurs-12-cn-28-oic-acid²9、甾体及萜类如a-香树7 脂醇、鞣质和挥发油等。地骨皮主要含有有机酸类、二酰胺类、八肽、生物碱类以及酚类等化合物。有机酸类化合物[32-33]亚油酸、亚麻酸、蜂花酸以及肉桂酸等。二酰胺化合物3]地骨皮甲素(KukoamineA)以及枸杞酰胺(Lyciumamide)等。地骨皮甲素有明显的降压活性。八肽类化合物35-36]lyciuminA,lyciuminB,lyciumin在于第三个氨基酸是Trp而不是Tyr。它们均有抑制ACE活性和血管紧张肽原酶(renin)活性的作用。生物碱类化合物137-38]甜菜碱等。1990年Ymada等从地骨皮中分离出两种生物碱，并命名为alkaloidA和alkaloidB,这两种生物碱具有抑制葡萄糖苷酶，抗肿瘤、增强免疫力和抗病毒等作用。其他生物碱也包括阿托品(atropine)、东莨宕碱(scopolamine)从地骨皮中还分离出柳杉酚、色氨酸衍生糖苷(tryptophanderivativeglycoside)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、东莨宕素(scopoletin)甘草中主要有三萜类化合物、黄酮类化合物等。三萜类化合物甘草甜素是甘草根及根茎中所含一种五环三萜皂苷；甘草次酸(Glycyrrhetinicacid)是甘草甜素的皂苷配基，也是甘草甜素的有效活性成分之一。黄酮类化合物甘草黄酮类物质包括了甘草素(Liquiritigenin)、异甘草素(Isoliquirige甘草苷(Liquiritin)、异甘草苷(Neoliquiritin)、新甘草苷(Neoliquiritin)、新异甘草苷 近年来，并未见到对泻白散复方的化学研究。药物化学研究内容的局限，缺乏对泻白散复方方药效物质或药效成分的研究，同时泻白散各单味药及复方的质量评价标准尚未建立。3.1桑白皮的药理研究现代研究表明，桑白皮药理活性比较广泛，主要是有一定的降血压、利尿及镇静作第一章泻白散复方配伍的研究概况8桑白皮丙酮提取物能够使豚鼠肠系毛细血管交叉数目明显增加，改善血流状态，增加血流速度；在离体条件下，显著抑制苯肾上腺素引起的主动脉血管环的收缩，在预加优降糖或普萘洛尔孵育下，其对苯肾上腺素引起的主动脉血管环的收缩作用仍然有舒张作用，并均具有量效关系，但引起去内皮后大鼠胸主动脉环收缩；桑白皮非丙酮提取物能明显增加血管内NO含量，表明其扩张血管作用是通过促进血管CNOS的合成，增加血管NO含量，引起血管舒张。桑白皮乙醇提取物可以显著延长大鼠的凝血时间，对大鼠体内血栓形成时间以及对凝血酶原时间未见明显影响。其作用机理可能是桑白皮所含桑根素、氧二氢桑根素 (oxydihydromorusin)及桑酮C能够抑制血小板环氧化酶合成血栓素B₂的形成。桑酮(G、H)、桑呋喃(C、F、G)、桑根酮(C、D)等成分具有较为显著的降血压作用。桑白皮的甲醇提取物对组胺、5-腔色胺，缓激肽和透明质酸等诱发的皮肤浮肿有抑制作用，同时又能抑制炎症引起的蛋白渗出及白细胞游走，对植物如棉球诱发的肉芽肿、甲醛及佐剂关节炎也有疗效。小鼠口服甲醇提取物的水溶性成分，能抑制醋酸诱导的扭体反应，其提取物的水溶性部分和丁醇部分对压迫刺激有镇痛作用。桑白皮丙酮提取物高剂量组(3g/kg)对氨水引起的咳嗽有明显的镇咳作用，而低剂量(1.5g/kg)组则无明显的镇咳作用，但可以显著性延长咳嗽潜伏期，无论高剂量和低剂量均可显著性增加小鼠支气管酚红排出量，并呈剂量依赖关系。桑白皮丙酮提取物高剂量组对乙酰胆碱引起的豚鼠痉挛性哮喘有明显的平喘作用，并指出其远离可能是通过提高支气管NO含量，松弛支气管平滑肌来达到平喘作用。有研究表明，桑白皮60%乙醇提取液的丙酮萃取物通过剂量依赖对抗白三烯D4(LTD4)引起豚鼠气管水肿(减少气管组织重量和伊文思蓝渗出量)以及LTD4和组胺引起豚鼠气管痉挛收缩而产生平喘作3.1.4抗癌、抗病毒作用[41]桑根白皮素(morusin)、桑酮(kuwanonA、C、J、L)和桑根酮(sanggenonA、B、C、D)对金葡菌和枯草杆菌，粪链球菌，耻垢分支杆菌等有抗菌活性。羟二氢桑根皮沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究9素，chalcomoracin等衍生物对研究发现，桑根白皮素(morusin)、桑呋喃G、桑酮(kuwanonG、M)和桑根酮 (sanggenonD)均可抑制十四烷酰氟波醇乙酸酯(TPA)与细胞受体结合。桑酮(KuwanonH)、桑根酮(sanggertonA、D)对促癌因子杀鱼菌素的蛋白激酶C有剂量依赖的抑制作用，对促癌因子鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性的诱导有抑制作用。一种被称为MoranA的糖蛋白可能是桑白皮降血糖活性成分，因为MoranA能明显降桑白皮75%乙醇提取液能明显抑制猪小肠蔗糖酶活性，从而使葡萄糖生成减少，同地骨皮中的酰胺类物质如N-二氢咖啡酰酪氨、N一反咖啡酰酪胺、N一顺咖啡酰酪地骨皮具有免疫调节作用，在不同的免疫状态下具有不同的调节作用。其水煎剂对正常小鼠脾细胞产生白细胞介素-2(IL-2)有抑制作用，对环磷酰胺所致小鼠脾细胞IL-2是增强免疫功能的一条重要途径。地骨皮的有效成分桂皮酸具有升高白细胞的作用，同时对受辐射损伤的白细胞减少、血小板减少都有明显的提高作用地骨皮中所含的环戊烷并吡咯烷型生物碱是一中葡萄糖苷抑制剂，可用作免疫调节剂来杀死病毒和抑制肿瘤。药理研究表明，地骨皮不仅能降低小鼠葡萄糖和肾上腺素性高血糖值，而且对四氧嘧啶(alloxan,ALX)致实验性糖尿病小鼠的血糖也有降低作用，作用与苯乙双胍降糖效果相似，并有一定量效关系及时间依赖性，时间越长或剂量越高，其作用越显著。地骨皮解热有效成分主要为甜菜碱。研究证明，地骨皮和枸杞对皮下注射角叉菜胶所致的大白鼠体温升高均有明显控制作用，解热作用较强，药效持久，强度可与解热镇通过扭体法、热板法和齿髓致痛法等动物实验模型表明地骨皮可明显抑制小鼠扭体反应次数，提高小鼠热致痛及家兔电刺激致痛痛阈值。从而表明其具有镇痛作用。3.2.6降压作用射、肌肉注射或灌胃均有明显的降压作用。其降压作用的实现可能与地骨皮中含有众多抑制血管紧张素转换酶(ACE)的成分有关。3.2.7抗生育作用5]地骨皮注射剂能显著的兴奋未孕大鼠与小鼠的离体子宫，可加强其收缩活动，而宫缩是孕娠终止的一个方面，由此可看出地骨皮有抗生育的潜在作用。殷军S²1发现，地骨皮极性成分处于在水、30%醇层时对成骨样细胞UMR106的增殖有明显促进作用，尤其实在水层中呈明显量效关系，当生药浓度为200×10²mg/mL时，平均增殖率为187%,作用最强。由此可知其内含有直接刺激成骨样细胞增殖的成分。还有研究表明地骨皮里含有褪黑激素(MT),可通过改变生物节律来有效地促进生甘草甜素及甘草次酸等对健康人及多种动物都有促进钠水潴留及钾的排泄增加，长期应用可出现水肿及高血压等症状。小剂量甘草素具有抗黄疸作用和免疫抑制作用，糖皮质激素样作用，大剂量时糖皮质激素样作用不明显，只呈现盐皮质激素样作用。甘草能提高机体的内分泌调节能力，起到扶正固本的治疗作用。3.3.2对消化系统的作用甘草次酸和总黄铜(FM100),有抑制胃酸分泌的作用，并可促进溃疡的愈合。临床应用甘草粉、甘草浸膏、甘草流浸膏、甘草次酸和FM100治疗胃溃疡均有较好的疗效作用。甘草次酸药(生胃酮)被西欧列为对上消化道溃疡的治疗药物。其抗溃疡作用与促进纤维细胞合成纤维及基质有关。FM100是甘草有效的解痉成分，甘草煎剂、甘草流浸膏、FM100及甘草素、异甘草素对离体肠管有明显的抑制作用。其中以黄酮中类成分 沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究的异甘草素作用最强。抗炎成分为甘草酸、甘草次酸及甘草黄酮类成分，具有糖皮质激素样作用，保太松或氢化可的松样的抗氧作用。实验研究表明，甘草酸对大鼠腹腔巨噬细胞有选择作用，甘草能抑制PGE2作用及减少内源性PGE2的产生，并能明显降低酵母糖及PGE2引起的cAMP升高，并可减少由酵母糖刺激巨噬细胞释放的PGE2,。甘草次酸对大鼠棉球肉芽肿，甲醛性脚肿均有抑制作用，其抗炎效价为可的松或氢化可的松的1/10。甘草黄酮有抑制小鼠角叉菜胶肿和抑制敏感细胞释放化学介质的作用。甘草酸类化合物通过对多种病毒颗粒的直接作用和诱生干扰素，增强天然杀伤细胞和巨噬细胞的活性等活化宿主免疫功能的间接作用，而发挥广谱的抗病毒作用。甘草酸能抑制体外HIV的增殖作用，给艾滋病毒患者连续注射甘草甜素1个月，可使部分患者血清中病毒抗原浓度降至未能测出的水平。甘草甜素能抑制肝中单纯疱疹I型病毒糖蛋白的合成，从而抑制病毒的复制。甘草多糖具有明显的抗水泡病毒、单纯疱疹I型病毒和牛痘病毒的活性。甘草次酸还具有干扰素诱导作用。甘草酸胺能提高小鼠NK细胞甘草的醇提物及甘草酸钠在体外对金黄色葡萄球菌、结核杆菌、大肠杆菌、阿米巴原虫均有抑制作用。3.3.6抗肿瘤作用实验研究表明β-甘草次酸较α-异构体更有效的抑制强致癌物质(苯并芘，黄曲霉素等)的致癌作用。甘草甜素和甘草次酸均有对人学中干扰诱导作用能力，生成γ一干扰素，能防止化学致癌物质氨基偶氮苯引起的肝损害，还可预防肝癌的发生和由化学物质引起的肝病变。甘草次酸及其衍生物3-0-18-α一甘草次酸对骨髓瘤有抑制作用，对小鼠移植性肿瘤也有良好的抑制作用。实验研究表明，甘草能增强细胞的解毒作用和抵抗力，也有抗白血病的作用。甘草甜素能抑制组胺释解剂48/80引起的肥大细胞脱颗粒反应，从而阻止了过敏介质的释放，还能抑制被动皮肤过敏反映，并能拮抗组胺、乙酰胆碱及过敏慢性反应物质 (SRS-A)对兔离体回肠和豚鼠离体气管的收缩作用。甘草提取物LX对小鼠过敏具有保护作用，并可明显降低青霉噻唑致敏豚鼠的休克发生率和死亡率。甘草多糖具有激活小鼠脾脏淋巴细胞增殖效应，是一种很有希望得免疫调节剂。甘草酸给小鼠腹腔注射，能使抗体产生显著增加；甘草多糖有激活小鼠淋巴细胞增殖作用。3.3.8解毒作用甘草流浸膏及甘草甜素对某些药物中毒、食物中毒、细菌毒素、农药中毒、体内代谢产物中毒都有一定的解毒作用。解毒机理为甘草甜素对毒物有吸收作用，甘草酸水解产生1个分子的甘草次酸和2个分子葡糖糖醛酸，而葡萄糖醛酸具有解毒作用，以及甘草甜素有肾上腺皮质激素样作用。甘草流浸膏及甘草酸对水合氯醛、士的宁、乌拉坦、可卡因、苯砷、升汞等毒性有较明显的解毒作用；对印防己毒素、咖啡因、乙酰胆碱、毛果云香碱、烟碱、巴比妥等解毒作用次之；对阿托品、索佛拿、毒扁豆碱、吗啡、锑剂则无效；对肾上腺素及麻黄碱反而有轻度增加其毒性的作用。甘草酸对河豚毒、蛇毒有解毒作用；还能解除白喉毒素、破伤风毒素的致死作用。甘草制剂配合喜树碱、农吉利碱治疗肿瘤可降低毒性并有增加疗效作用。甘草酸铵与喜树碱和环磷酰胺合用，可增加疗效，并降低喜树碱的毒性；甘草酸钙对链霉素具有明显的解毒作用。甘草酸及甘草次酸还能抑制四氯化碳生成游离基及过氧化脂质。3.3.9镇咳祛痰作用甘草黄酮、甘草次酸及其衍生物有镇咳作用，其镇咳作用是通过神经中枢产生的，甘草次酸胆碱盐是镇咳作用最强的成分。甘草次酸氢化琥珀酸双胆盐的镇咳作用与可待因接近。甘草能促进咽喉支气管的腺体分泌，具有祛痰作用。3.3.10降脂作用及抗动脉粥样硬化作用甘草甜素能促进胆固醇含量降低、磷脂质明显下降，中性脂肪β-脂蛋白、游离脂肪酸亦有下降。甘草甜素可抑制机体和血管壁的炎症反应，可防止动脉粥样硬化的发生及发展。 甘草酸有明显的降脂作用，能阻止大动脉及冠状动脉粥样硬化的发展，如甘草单胺 (MAG)对家兔和大鼠实验性动脉粥样硬化有明显的降低血胆固醇、β-脂蛋白即三酸甘油脂作用；甘草酸盐有抑制磷脂酶A₂活性作用，也可以抑制血小板的凝集作用。3.3.11抗脑缺血作用甘草酸预先给药20mg/mg,并连续给药4mg/mg,1天2次，能明显提高再灌注大犬3.3.12抗利尿作用甘草酸对大鼠有抗利尿作用，钠排除量减少，钾排除量也轻度减少；甘草增加肾小管对钠和氯的重吸收，而呈现利尿作用，其作用方式与去氧皮质酮不同，可能是对其肾小管的直接作用有关。3.3.13解痉镇痛作用甘草对眼睑肌痉挛、肠肌痉挛及血液透析出现的肌痉挛有效；FM100和异甘草素等黄酮类化合物，对动物离体肠管有抑制作用，并能解除乙酰胆碱、氯化钡、组胺所致的肠痉挛，具有罂粟碱样特异性的解痉能力。3.3.14其他甘草酸能减轻链霉素对前庭神经的损害，甘草酸与链霉素碱基结合生成甘草酸链霉素后，不影响其体外抗菌活性外，但能减轻链霉素对耳前庭神经的损害；甘草次酸有提高豚鼠内耳听觉功能的作用。甘草次酸能引起假醛固酮增多，引起高血压、水肿、低血钾、低肾素、高醛固酮活性等。甘草能治疗老年骨质疏松症。甘草附子汤对老年性腰背痛、胸椎腰椎压迫性及疲劳性骨折的疼痛，或卧床翻身、排便困难者都有良好的止痛作用。近年来，并未见到对泻白散复方的药理学研究。4中药谱效关系的研究概况[54中药成分极其复杂，尤其是复方，测定少数几种有效成分或指标成分，不足以保证复方即制剂质量[SS]。从中医的观点看，对指标成分的控制，难以真正控制中药药效。黄连素与黄连、甘草酸与甘草、人参皂甙与人参等在中医看来是两回事。中药的“补气”、的整体作用结果。这些物质群的整体情况，包括其所含的物质数、物质量和组成比例差异，都会对药效发生影响。所以要控制中药药效，不能只针对某一、二个化学成分，必有效部位或有效成分的种类，建立全面反映其成分方成分的整体性和综合作用，更好地评价中药复方计量学的理论与方法，进行数据解析和特征信息的立多模式多柱色谱、多元检测、多水平评价的系统制剂的质量，更具有实际应用价值。中药复方指纹的中药指纹图谱与功效结果相对应起来，将中药指评价标准提供规律性的科学依据，从而建立中药产E质量的质量标准，真正对我国中医药现代化、国际沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究第二章泻白散高效液相色谱分析方法的建立岛津LC-ATvp高效液相色谱仪，包括：岛津LC-Atvp泵系统，SPD-M10Avp二极管阵列检测器(190～800nm),Class-VP色谱工作站；天平(北京光学仪器厂);ModelC3860超声振荡仪(天津开发区色谱分析仪器有限公司);微量进样器(美国HAMILTON公司);ZFQ85A型旋转蒸发仪(上海医械专机厂);1.2试剂与药材色谱醇乙腈(天津市康科德科技有限公司);色谱甲醇(天津市康科德科技有限公司)娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);冰醋酸(分析纯，沈阳化学试剂厂)桑白皮、地骨皮、甘草药材购自沈阳成大方圆药店，经刘晓秋教授鉴定为正品。桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，地骨皮为茄科植物枸杞Lyciumchinense粉碎，过60目筛。色谱柱：AngilentTC-Ci₈(150mm×4.6mm,5μm),安捷伦科技公司检测波长：274nm;分析时间：45min;0001.4样品制备取处方量药材，加10倍量水，加热至沸，并保持微沸30分钟，过程中随时补水至足量。纱布过滤后，滤液浓缩至近干，加入95%乙醇，使含醇量达50%,静置冷藏12h,过滤后回收乙醇并减压低温浓缩成浸膏粉末，用时配成10mg/mL浓度，离心并微孔滤膜过滤后进样。2条件选择及方法考察2.1提取方式的选择考虑到古方以水为提取溶媒，同时兼顾液相测定的具体条件，本试验选择了3种提取方式：(1)取1/10处方量药材，用10倍量50%乙醇回流提取30min,回收乙醇并定容至(2)取1/10处方量药材，加10倍量水，加热至沸，并保持微沸30分钟，过程中随时补水至足量。纱布过滤后，滤液浓缩至近干，加入95%乙醇，使含醇量达50%,静置冷藏12h,过滤后回收乙醇并定容至25mL,立即进样。(3)取1/10处方量药材，加10倍量水，加热至沸，并保持微沸30分钟，过程中随时补水至足量。纱布过滤后，滤液浓缩至近干，加入95%乙醇，使含醇量达50%,静置冷藏12h,过滤后回收乙醇，浓缩至近干，加入95%乙醇，使含醇量达85%,静置冷藏12h,过滤后回收乙醇并定容至25mL,立即进样。试验结果表明50%乙醇提取物与水提醇沉相比水溶性成分减少且脂溶性成分干扰较大，因此选择水提醇沉为提取方法；并且先醇沉至含醇量50%再沉至含醇量85%对样品的峰数量及峰面积影响不大，因此选择醇沉至含醇量50%即可。所以，本实验选择(2)法为提取方法。2.2样品贮存方式的选择在本实验过程中，HPLC研究和药效学研究须为同一份样品，考虑到药效学实验的周期较长，因此样品需要有较长时间的稳定性，因此本文考察了两种样品的贮存方式：(1)样品以水溶液形式贮存。如项2.4.1所述提取样品，于0、1、2、3、4、5、6h 进样20μL,记录色谱图。如图2-1、2-2所示，在6个小时内，新生成了9号峰。选择图2-x所示的11个峰为对象，读取其峰面积，并计算上述峰的峰面积的RSD值如表2-2所示，结果显示峰面积相差较大，样品水溶液在6h内不稳定。1234567890(2)样品以浸膏粉末形式贮存。于0、2、4、8、24、72h称取样品浸膏粉末0.1g,用水溶解并定容至25mL,进样20μL,记录色谱图如图2-3。选取其中11个峰，以相对峰面积为对象，考察其72h内的峰面积变化，其RSD值如表2-4所示。实验结果表明，以浸膏粉末形式保存，样品稳定性好，所以选择以浸膏粉末形式保2.3流动相的选择分别考察了如下流动相：甲醇-0.5%三乙胺水溶液；甲醇-1%冰醋酸水溶液；1%冰醋酸甲醇溶液一水溶液；乙腈-1%冰醋酸水溶液；乙腈-0.5%冰醋酸水溶液；乙腈-0.1%冰醋酸水溶液；实验结果表明，乙腈作为有机相能够达到较好的分离效果，水相中加入冰醋酸能够改善峰分离，但是与乙腈-水系统并无实质改变，且水相中冰醋酸的浓度对分离的影响不大，考虑到酸对色谱柱有损害，因此选择乙腈-水系统。320nm检测波长下泻白散样品溶液的指纹图谱，结果在274nm下图谱峰形好、信息多，分离效果好，因此选择274nm波长记录保留时间和峰面积。2.5色谱柱的选择本实验曾选用三种反相C18色谱柱：(1)DiamondC18(200mm×4.6mm,5μm),迪马公司；(2)KromaisilC18(200mm×4.6mm,5μm),天津开发区色谱分析仪器有限公司；(3)AngilentTC-C18(150mm×4.6mm,5μm),安捷伦科技公司。试验结果表明，AngilentTC-C18(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱的分离较好，保留时间适宜，因此选择此色谱柱为本实验检测色谱柱。2.6进样量的选择取同一样品，分别进样10μL和20μL,比较色谱图，实验结果表明，进样量对指纹图谱的结果影响不大，但加大进样量可以减弱梯度洗脱时的基线漂移程度。进样量为本实验为了取得较好的分离度，曾选择了0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min,实验结果表明0.8mL/min的流速分离效果最好，因此选择0.8mL/min为本实验的流速。2.8稳定性试验分别于0、2、4、8、72小时精密称取1号样品浸膏0.1g,溶解并定容至25mL,吸取20μL进样，记录保留时间(RT)和峰面积(A),结果保留时间、峰面积的RSD均小于5%,结果见表2-3、2-4。1234沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究56789Tab.2-4Stabilityofdetermination(powder,peakarea)精密吸取5批1号样品供试液，按上述色谱条件时间(RT)和峰面积(A)的RSD均小于5%,结果,分别进样，记录色谱图。见表2-5、2-6。12345678912345123456789实验表明，该色谱条件稳定，能够作为泻白散HPLC图谱的色谱条件。3高效液相色谱图中峰的归属高效液相色谱图共标定12个峰，图谱总分析时间为45分钟。以2.1、2.2所述的样品制备贮存方式制备各单味药的样品，对照各单味药的色谱图，对12个峰进行归属，如图2-4所示。结果表明，1、2、3、4、5、10号峰为桑白皮的峰，6、7、8、9、11号峰为甘草的峰。色谱图中没有归属到地骨皮的相关峰。记录各峰的紫外扫描图(190-380nm)如图2-5所示。4小结与讨论(1)由于样品以溶液形式存在非常不稳定，所以通过试验决定采用粉末形式保存，在进样前溶解测定。(2)通过试验建立了高效液相的色谱分析方法。(3)高效液相色谱中共标定了12峰，并对其进行了归属，1、2、3、4、5、10号峰为桑白皮的峰，6、7、8、9、11号峰为甘草的峰。色谱图中没有归属到地骨皮的相关峰，这可能是因为样品以水溶液形式存在，多种成分互相作用下，影响了某些成分的稳定性。。缺9号峰158526.4835.31Fig.2-1HPLCofsample'ssolution(Oh)Fig.2-2HPLCofsampl沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究Fig.2-3HPLCofsample'spowder(0-7第二章泻白散高效液相色谱条件的建立Fig.2-4AssignmentofXiebaiPowder'sHPLC(A:Recipe;B:CortexMori;C:Radixet泻白散谱效关系的研究沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究152637spectrumofpeaks48ContinuedFig.2-5UVscanningspectrum算机技术将化学数据与药效学数据相关联，得到该复方1药效学试验昆明种小白鼠，体重20±2g,子性，由沈阳药科大学动物实验中心提供。生理盐水(自制);二甲苯(分析纯，沈阳试剂一厂);酚红(天津博迪化工有限公司);桑白皮、地骨皮、甘草药材购自沈阳成大方圆药店，经刘晓秋教授鉴定为正品。桑白皮为桑科植物桑MorusalbaL.的干燥根皮，地骨皮为茄科植物枸杞Lyciumchinense粉碎，过60目筛。小鼠灌胃器(自制);6mm打空器(自制);电子分析天平(北京光学仪器厂);微量移液器(美国HAMILTON公司);1ml注射器(常州医疗器材总厂);紫外可见分光光度计(UV9100,北京瑞利分析仪器有限公司);岛津LC-ATvp高效液相色谱仪，包括：岛津LC-Atvp泵系统，SPD-M10Avp二极管阵列检测器(190～800nm),Class-VP色谱工作站；1.2药理指标的选择方剂的药理学研究是揭示中药方剂组成原则和配伍变化的中药方法，也是开发研究新的中药制剂不可缺少的手段。泻白散，具有清泻肺热、平喘止咳的功用，方中桑白皮主入肺经，倾泻肺热，平喘止咳，为君药。地骨皮甘寒入肺，可助君药泻肺中伏火，且有养阴之功，君臣相合，清泻肺火，以复肺气之肃降。呼吸系统药物研究主要采用镇咳、祛痰、平喘等药理实验方法，本文选择了祛痰实验方法，同时，由于咳嗽普遍伴随炎症反应，本文还选择了抗炎实验方法对泻白散进行药效研究。祛痰实验常用如下3种方法：(1)气管酚红法。常用小鼠或家兔，通过给动物腹腔或静脉注入一定量的酚红，可部分的从气管分泌排除，从动物气管中排泌酚红的量，来确以一定时间内吸取痰液量的多少，来判断药物的排痰效果。(3)气管纤毛黏液流运动法：常用家鸽、家兔，以墨汁为标记(也可用染料、炭粉、软木粒等),观察一定时间内墨汁在气管黏膜表面运动距离的长短，判断药物的排痰效果。急性非特异性炎症模型包括如下3种方法：(1)大鼠足跖肿胀法，实验常采用的致炎剂有角叉菜胶、酵母、琼酯、右旋糖酐、甲醛、鸡蛋清等致炎剂。此法形成的炎症模型可靠。(2)鼠耳肿胀法，实验常采用二甲苯或混合致炎液致炎，本法复制成功率高，适用于新抗炎药常规筛选。(3)白细胞游走法，以明胶引起小鼠腹腔中嗜中性白细胞数升高，观察药物的抗炎作用。考虑到标本兼治、中西医结合等原则，结合药效选择了2个药理指标：抗炎(小鼠耳肿胀法)、祛痰(小鼠气管酚红法)。试验设计是试验过程的依据，也是试验研究质量的一个重要保证。正交试验设计是研究处理多因素试验的一种科学方法，它利用正交表(Orthogonallayout)安排试验，沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究齐可比”的特点，“均匀分散”使被挑选的点具有代表性，“整齐可比”使结果便于分析。泻白散由桑白皮30g,地骨皮30g,甘草6g组成。选择处方中3味药物构成3个因试验，共进行9次试验。各因素水平见表3-1,试验安排见表3-2C1623391234567891123312231A:CortexMori;B:Cortex取处方量药材，加10倍量水，加热至沸，并保持微足量。纱布过滤后，滤液浓缩至近干，加入95%乙醇，使含醇量达50%,静置冷藏12h,1.5小鼠的抗炎试验(二甲苯致小鼠耳肿胀法)选取小鼠，体重20±2g,子性，随机分组，每组10只，苦味酸标记，累计给药3天 称量，计算肿胀度，抗炎抑制率(R),实验结果如表3-3所示。 1234567891.6小鼠的祛痰试验(小鼠气管酚红法) 用721型分光光度计在546nm下测定OD值，计算祛痰指数，实验结果如表3-4所示。123456789**—p<0.01(和空白对照组比较)2样品的制备及高效液相色谱分析采用反相高效液相色谱法对第二章中9个不同配比提取液在色谱系统条件下绘制指纹图谱，获得尽可能多的化学信息。样品制备如3.1.4所述；仪器、试剂及色谱条件第二章1.3所述。对各处方色谱图进行分析，得到12个色谱峰，依次记为X1~X12,代表个色谱峰的峰面积。将此化学数据和表3-3、3-4的药理数据组成原始数据矩阵，见表3-5。采用化学统计学和计算机技术记性数据处理，确定该复方中药的药效物质基础。数据处理时将抗炎抑制率记为Y,将祛痰指数记为Y₂。Tab.3-5Originalchemicalof9different1234567891234567893泻白散谱效关系分析3.1相关分析第三章泻白散药效物质基础的确定相关分析是研究变量之间密切程度的一种常用统计方法。它包含双变量相关分析、偏相关分析和距离相关分析。当分析多个事物之间的关系，而这种关系又往往是变量之间的数量关系时，可以用双变量相关分析方法，并做出统计学推断。利用社会科学软件包SPSS中的双变量相关分析可以输出变量两两间的皮尔逊相关系数(PearsonCorrelationCoefficients),肯德尔相关系数(KendallCorrelationCoefficients)和斯皮尔曼Window98/NT的双变量相关分析方法处理所得Pearson相关系数，见表3-6、3-7。CTab.3-7PearsoncorrelC由表3-6、3-7可以看出：与祛痰药理指标密切相关的变量有：1、2、3、4、5号峰，均来自于桑白皮，它们与祛痰效应呈正相关，有增强作用。与抗炎药理指标密切相关的变量有：1、2、3、4、5号峰，均来自于桑白皮，它们与抗炎效应呈正相关，有增强作用。回归分析(Regression)是研究一个或多个自变量(Independents)与一个因变量 (Dependent)之间是否存在某种线性或非线性关系的一种统计学分析方法。根据多元回归自变量选择的不同，多元回归可以有多种不同的计算方法，SPSSforWindows98/NT的多重线性回归分析中提供了5种建立回归方程的方法：强迫引入法(Enter)、逐步回归法(Stepwise)、强迫剔除法(Remove)、后向逐步法(Backward)、前向逐步法(Forward)。沈阳药科大学硕士学位论文泻白散谱效关系的研究利用强迫引入法(Enter)处理所得结果如表3-8所示。256789采用回归分析一次分析化学数据和上述二项药理指标的关系，结果表明在12个色谱峰中有8个与药理数据密切相关的色谱峰被引入回归方程。它们依次为2、5、6、7、8、9、10、12号峰所代表的化学成分。其中2、5、10号峰来自于桑白皮，6、7、8、9号峰来自于甘草。综合相关分析和回归分析结果，12个色谱峰中的2、5号色谱峰所代表的化学成分(化学成分群)与药理密切相关。通过对2号峰和5号峰的紫外扫描图，如图3-1所示。2号峰和5号峰所对应化学成分均在290nm和325nm左右有紫外吸收。通过与文献2对比，判断其可能为二苯乙烯苷类成分。4小结与讨论(1)通过实验得出了9组配方的高效液相色谱图并与相对应的处方进行了祛痰作用和抗(2)相关性分析结果表明在12个色谱峰中有5个与药理数据密切相关的色谱峰与祛痰和抗炎作用呈正相关，其均来自于桑白皮。(3)回归分析结果表明在12个色谱峰中有8个与药理数据密切相关的色谱峰被引入回归方程。它们依次为2、5、6、7、8、9、10、12号峰所代表的化学成分。其中2、5、10号峰来自于桑白皮，6、7、8、9号峰来自于甘草。(4)综合回归分析和相关性分析结果，确定与泻白散祛痰和抗炎作用密切相关的为2号峰和5号峰所代表的化学成分，其均来自于桑白皮。通过对其在紫外190-380nm下扫描可得其在290nm和325nm处有最大紫外吸收，通过对比文献，判定其为二苯乙烯苷类成分。第三章泻白散药效物质基础的确定与法，标定了其中12个色谱峰，并对其中11个峰进:号峰为桑白皮的峰，6、7、8、9、11号峰为甘草的关峰，这可能是在样品制备的过程中地骨皮成分损〔样品制备方式所得的成分在紫外下没有吸收所致；名的稳定性。通过试验决定采用粉末形式保存，在进在6个小时内，色谱峰面积迅速发生变化，并且出舌以粉末形式保存，色谱峰面积在3天内保持稳定。:多种成分相互作用下，影响了某些成分的稳定性。写白散进行祛痰作用和抗炎作用的研究，实验表明正炎、祛痰作用，并采用相关分析和回归分析对泻白果表明有5个与色谱峰与祛痰和抗炎作用呈正相关，乏明有8个与药理数据密切相关的色谱峰被引入回归3、10、12号峰所代表的化学成分。其中2、5、10号E自于甘草。综合回归分析和相关性分析结果，确定匀为2号峰和5号峰所代表的化学成分，其均来自于桑扫描可得其在290nm和325nm处有最大紫外吸收，通关成分。咳、祛痰、平喘等药理实验方法，本文选择了祛痰炎症反应，本文还选择了抗炎实验方法对泻白散进对泻白散谱效关系的报道，也无对泻白散血浆移行[苯乙烯苷类成分进行谱效关系的进一步研究，确定[2]KazuhiroHirakura,ToshioFukai,YoshioHanonand,etal.ANatualDiel-AlderTypeRootBarkofMoursIhou[J].Phytochemistry,1985,24(1):159[3]JunkoIkuta,TohioFukai.ConsituentsofMorusalbaL.cellCultures[J].Chemical&PharmaceutBulletin,1986,34(6):2471-2478.[4]YoshioHano,Kazuhra.CompomentsofRootBarkofMorusIhou[J].PlantaMedica,1984,50(2):127-133.[5]ToshioFukai,YoshioHano.StructuresofaNovelDerivativefromtheCultivateBulletin,1985,33(10):428[6]KazuhiroHirakura,YoshioHano.StrucuresofthreeNewNaturalDiels-AlderPandX,andMulberrofuranJ,fromthPharmaceuticalBulletin,1985,33(3):1088-1096.[7]YoshioHano,HiromiTsubura,StruCultivatedMuberryTree(MorusalbaL.)[J].Heterocycles,1986BarkofaMulberryTree[J].Heterocycles,1989,29(4):807-813.[12]JinYinSun,YoshiMorusmonglicaSchneider[J].Heterocycles,1989,29(1):1[14]Ya-Qinshi,ToshioFukai.CytotoxicFlavonoidswithIsmonlica[J].JournalofNaturalProducts,2001,64(2):181-188.[15]ToshioFukai,Yue-Hupei.ComponentsoftheRootBarkofMorusHeterocycles,1996,43(2):425-436.[16]Shi,Ya-Qin,Fukai,Toshio.PhenolicConstituentsoftheRootBarkofChineseMorusaustrslis[J].NaturalMedicines(Tokyo,Japan),2001,55(3):143-146.[17]YoshioHano,TsuyoshiOkamoto.ComponetsoftheRootBarkofMorusinsignisBur[J].Heterocycles,1993,36(6):1359-1366.[18]YoshioHano,TsuyoshiOkamoto.ComponetsoftheRootBarkofMorusinsignisBur[J]