第一章第二节发酵工程的无菌技术课件高二下学期生物选择性必修3

第一章发酵工程第二节发酵工程的无菌技术（第1课时）新课引入

19世纪中期以前，人们普遍相信生命现象是自然发生的。19世纪60年代，法国科学家巴斯德通过实验证明了微生物不是自然发生的。煮沸肉汤，杀灭其中的细菌肉汤仍澄清，没有细菌繁殖打断瓶颈肉汤变混浊，细菌在肉汤中繁殖巴斯德的成功取决于他重视实验的无菌操作。分析上述事实，他的无菌操作体现在哪些方面？通过高温加热曲颈瓶中的肉汤，又通过开口的曲颈和外界相通。这样既能杀死瓶内的各种微生物，又能阻隔外界微生物进入烧瓶。

日常生活中，我们会用碘伏消毒液擦拭受伤破损的皮肤，从而杀灭伤口部位的部分微生物。那么，在发酵工程实践中无菌操作是如何开展的呢？一、发酵工程的灭菌方法阅读课本第14~15页发酵工程的灭菌方法的内容，思考：什么是无菌技术？无菌技术的核心是什么？常用的灭菌方法有什么？学生活动在操作过程中，保持的________________无菌状态并不被微生物污染的技术，其核心是______。1．无菌技术获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础，因此，无菌技术是发酵工程的重要技术之一。物品与操作区域灭菌（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。（2）用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。拓展1无菌技术的主要内容（1）化学试剂灭菌法2．常用方法方法效果范围利用化学试剂如甲醛、氯、高锰酸钾等灭菌剂。破坏微生物的蛋白质或细胞结构。一般不用于培养基的灭菌。（2）射线灭菌法方法效果范围利用紫外线、X射线、γ

射线等产生的高能粒子进行灭菌。破坏微生物的蛋白质或细胞结构。一般用于表面和空气的灭菌。（3）干热灭菌法干热空气灭菌法火焰灼烧法方法对象物品放入干热灭菌箱，140～160℃，2～3h。直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧。耐高温、需要保持干燥的物品（如培养皿、接种针和移液管）的灭菌接种工具、金属器具、试管口或瓶口等。（4）湿热灭菌法培养基等。温度为121℃、气压约100kPa的条件下维持15~20min。蒸汽穿透力大，在相同温度下湿热灭菌比干热灭菌更有效。方法对象优点（5）过滤除菌法大量地制备无菌空气，用于好氧微生物的发酵。利用过滤除菌法处理料液，以获得无菌产品。通过过滤阻留微生物从而达到除菌目的。方法对象项目消毒灭菌条件使用较为温和的物理、化学或生物等方法使用强烈的理化因素原理杀死物体表面或内部一部分的微生物(不包括芽孢和孢子)杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子适用范围实验操作的空间、操作者的衣物和手微生物的培养皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法和使用体积分数为70%的酒精消毒等干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法和灼烧灭菌法等消毒和灭菌的区别常用的消毒方法煮沸消毒法：在100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。这是日常生活经常用到的消毒方法。巴氏消毒法：在62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s～1min，适用于不耐高温的液体，例如牛奶，可杀死牛奶中的绝大多数微生物，且不破坏牛奶的营养成分。化学药物消毒：如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。紫外线消毒：接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前,适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。什么是芽孢和孢子呢？芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3h以上才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散，当环境适宜时可以萌发形成一个细菌。

孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞。能直接发育成新个体。拓展2在具体的研究或生产实践中，上述几种方法有时可以结合使用，灭菌效果会更为显著。灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。在科学研究或生产实践中，灭菌需要采用相应的灭菌设备。发酵工程中常用的灭菌设备有哪些呢？二、发酵工程的灭菌设备阅读课本第15~17页发酵工程的灭菌设备的内容，思考：常用的发酵设备有哪些？这些常用发酵设备的原理和作用是什么？说出高压蒸汽灭菌锅的使用步骤。学生活动二、发酵工程的灭菌设备空的玻璃器皿（如培养皿、离心管、移液管）、金属用具（如镊子、手术刀）和其他耐高温的物品（如菌种保藏采用的沙土管、石蜡油、碳酸钙）使灭菌器皿保持干燥。带有胶皮或塑料的物品、液体及固体培养基一般不能采用电热鼓风干燥箱干热灭菌。对象优点缺点1．电热鼓风干燥箱菌体蛋白的凝固温度与含水量密切相关，细菌芽孢含水量低，蛋白质凝固温度较高。采用电热鼓风干燥箱干热灭菌时，一般以能否杀死细菌的芽孢作为彻底灭菌的标准。灭菌原理注意事项：不得将易腐、易燃、易爆物品放入箱内干燥灭菌；干燥箱在工作时，必须将风机开关打开，否则会导致电机或传感器烧坏；箱内应经常保持清洁，长期不用应套好防尘罩，放置在干燥的室内等。1．电热鼓风干燥箱一种高压蒸汽灭菌锅的结构示意图在一个密闭的锅内，水的沸点随蒸汽压力的增高而上升，加压的同时提高蒸汽的温度，使锅内的待灭菌物品在一定压力和温度等条件下，杀死其中所有微生物的营养体及其芽孢。灭菌原理手动式高压蒸汽灭菌锅；全自动高压蒸汽灭菌锅。培养基等。种类对象2．高压蒸汽灭菌锅操作人员必须在现场规范操作，严格控制热源维持灭菌时的压力。锅内压力过高，不仅培养基的营养成分会被破坏，而且高压锅超过耐压范围后可能会发生爆炸，造成伤人事故等。使用高压蒸汽灭菌锅有什么注意事项？加水装锅加热排空冷空气保温保压出锅在外层锅内加入适量的水，水量达到水位标记线即可将待灭菌物品放在灭菌桶中接通电源，打开开关，开始加热打开排气阀，排出锅内残留的冷空气。当压力表指针回降到“0”时，关闭气阀，继续加热。锅内压力升至约103kPa、温度达到121℃时控制热源，保持压力，维持15～20min

后，再关闭电源。当压力表指针降至“0”点，待温度下降后，打开排气阀，旋开固定螺栓，开盖，取出灭菌物品高压蒸汽灭菌锅的使用步骤：加水装锅加热排空冷空气保温保压出锅灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，保持灭菌锅内壁及内胆干燥，并盖好锅盖。高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到“0”时才能打开排气阀？在同一温度下，湿热的灭菌能力比热大，在使用高压蒸汽灭菌灭菌时，灭菌锅内冷空气的排出是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。

如果在压力未降到“0”时打开排气阀，会导致锅内压力突然下降，使器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾培养基而发生污染。

思考讨论3．空气除菌设备3．空气除菌设备（1）进行空气除菌的原因是什么？许多微生物产品是通过培养好氧微生物获得的。通常在空气中含有灰尘颗粒和各种杂菌，在阴雨天气或环境污染比较严重的情况下，空气中会悬浮大量的微生物。这些微生物一旦进入营养丰富的培养基中，会很快繁殖，影响发酵过程。3．空气除菌设备（2）作用机理让含菌空气通过____________________，以阻截空气中所含微生物。空气除菌设备不是灭菌，而是滤除了空气中的各种杂菌。无菌干燥的过滤介质（3）作用通过过滤除菌处理的空气可达到___________的程度，并有足够的压力和适宜的温度，以满足___________________的需要。几乎无菌好氧微生物纯培养

小结1．下列哪项不属于无菌技术？（）A．将培养皿、接种工具和培养基进行灭菌B．实验操作应在酒精灯火焰附近进行C．避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触D．操作者的衣着和手用纯净水洗干净D2．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌（

）A．接种环、移液管、培养基B．移液管、接种环、培养基C．培养基、移液管、接种环D．培养皿、移液管、培养基B3．下列关于高压蒸汽灭菌锅的使用方法中，错误的是（

）A．使用高压蒸汽灭菌锅时，需等锅内的冷空气排尽后再关闭排气阀B．培养基常用高压蒸汽灭菌法处理C．灭菌结束后，需迅速将排气阀打开，等压力表降为“0”时再取出培养基D．灭菌前一般需要将锥形瓶的棉塞用牛皮纸或报纸包扎好C第一章发酵工程第二节发酵工程的无菌技术（第2课时）发酵工程的灭菌方法有哪些？会用到哪些灭菌设备呢？借助发酵设备，使用一定的灭菌方法可以对发酵过程中使用到的培养皿等实验器具进行进行灭菌。发酵工程有哪些常用的无菌操作器具呢？

化学试剂灭菌法；射线灭菌法；干热灭菌法（电热鼓风干燥箱）；湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌锅）；过滤除菌法（空气除菌设备）。一、发酵工程的无菌操作器具阅读课本第18~19页发酵工程的无菌操作器具的内容，思考：常用的无菌操作器具有哪些？如何使用移液管量取一定体积的溶液？学生活动一、发酵工程的无菌操作器具1．接种器具在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程称为_____。在这一操作过程中，常用的接种器具包括__________________________等。接种玻璃涂布器、接种针、接种环2．转移器具（1）作用用来准确移取一定体积的溶液或分装化学试剂的量器，一般用于转移部分液体培养物、________________或分装化学试剂。系列稀释微生物（2）常用规格常用的移液管有1mL、5mL、10mL和25mL等规格。2．转移器具移液管的使用（3）使用步骤取管吸液放出溶液以拇指及中指捏住管颈标线以上的地方移液管插入待取溶液液面下约1cm出口尖端接触接收溶液的器壁；将容器微倾斜，使移液管直立；放松食指，使溶液自由地顺壁流下；待溶液停止流出后将移液管移出。（4）微量移液器当取液量很少时（如0.1mL），常采用微量取液器。微量取液器可分为固定容量的和可调容量的两种。3．超净工作台原理注意事项优点利用工作台内紫外线灯的杀菌作用，并通过空气过滤器过滤确保工作台内空气的无菌、无污染。超净工作台开机杀菌30min后，需先关掉紫外线灯，约10min后方可使用超净工作台。操作方便。在各种无菌操作和发酵工程产品的工厂化生产中，超净工作台是理想的无菌操作设备一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备。二、微生物接种和传代的无菌技术阅读课本第19页微生物接种和传代的无菌技术的内容，思考：（1）菌种是什么？（2）菌种保存的生理状态是怎样的？（3）菌种保存的条件和方法是什么？学生活动二、微生物接种和传代的无菌技术1．菌种保存和传代的原理（1）菌种菌种是食用菌、工业菌、农用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料，是从事发酵工程实践及微生物学等学科研究的基本材料和重要资源。（2）微生物保存的生理状态在人工创造的条件下，降低细胞的代谢水平，使细胞基本处于休眠状态，即微生物的生长繁殖受到抑制但又不至于死亡。（4）菌种保存的方法厌氧微生物接触氧气会受到抑制、损伤甚至死亡，常采用__________。

_________是常用的菌种传代和低温下保存菌种的方法。穿刺接种斜面接种（3）菌种保存的条件：____________________。低温、干燥、真空将培养好的装有新鲜菌种的试管用牛皮纸包扎好，置于4℃左右的冰箱中保藏，以减缓培养基的水分蒸发，延长保存时间（4）菌种保存的方法挑选典型菌落接种到斜面培养基，培养冰箱保藏2~3个月重新接种二、微生物接种和传代的无菌技术

（1）传代培养保藏法：包括斜面培养、穿刺培养等，培养后于4～6℃冰箱内保存。

（2）液体石蜡覆盖保藏法：在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间。

（3）载体保藏法：将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法。

（4）甘油管藏法：利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。

（5）冷冻干燥保藏法：先使微生物在极低温度（－70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分。拓展1菌种保存的常见方法二、微生物接种和传代的无菌技术

阅读课本第20页的内容，初步认识斜面接种和培养酵母菌的操作过程。学生活动准备接种接种环灭菌试管口灭菌挑取少量菌体划线接种培养酵母菌2．斜面接种和培养酵母菌①点燃酒精灯，取两支盛有培养基的试管，其中一支内有菌种，另一支为无菌的斜面培养基。（1）准备接种②用一只手的拇指和其他四指夹住试管，使管口齐平，管内培养基斜面向上。将接种环的环端和接种时可能进入试管的部分放在酒精灯火焰上，来回灼烧多次，彻底灭菌。（2）接种环灭菌在火焰附近用握有接种环的手的小拇指、无名指、中指和掌心拔去两支试管上的试管塞，迅速将试管口通过火焰2~3次，以杀灭试管口上的微生物。（3）试管口灭菌将灭过菌的接种环伸入菌种管，先将环部接触培养基斜面顶端或其他无菌体的培养基部位使其冷却，再轻轻挑取少许菌体。（4）挑取少许菌体在抽出接种环时，注意其带菌部位不要触及管壁或通过火焰。注意：迅速将上述带菌的接种环伸入待接种的试管中，在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线，将菌种接种到培养基上。（5）划线接种划线时注意不要将培养基的表面划破。注意：（6）培养将试管口与试管塞分别通过火焰2~3次，迅速塞紧试管。多次灼烧接种环确保无菌，冷却后，放回原处。将接种过菌种的试管放在恒温箱中（温度调至28℃）培养24h。二、微生物接种和传代的无菌技术根据实验操作流程进行酵母菌的斜面接种和培养。在此过程中注意不到烫伤、划伤。学生活动1．培养24h后，能观察到的实验结果是什么？如何将酵母菌培养在平板培养基上？

能观察到“Z”型折线分布的酵母菌菌落。

将无菌种的斜面培养基改为平板培养基，通过平板划线法或稀释涂布平板法可将酵母菌培养在平板培养基上。结果分析与评价2．在上述接种和培养过程中，我们注意到了哪些灭菌操作注意事项？

在酒精灯附近操作；灼烧接种环，在火焰旁冷却；将试管口通过火焰；接种完成后，再次灼烧接种环。

小结1．（多选）下列关于发酵工程中使用的无菌操作器具，叙述错误的是（）A．接种针常用于斜面接种或在平板培养基上划线接种B．超净工作台是一种经过空气净化而形成高洁净操作环境的设备C．将移液管插入待取溶液液面下时，伸越多取液越方便D．玻璃涂布器一般用于平板稀释涂布接种AC2．为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保存，下列有关叙述错误的是（）A．对于频繁使用的菌种，可以采用临时保存的方法B．甘油管藏法保存菌种时使用的甘油需灭菌C．临时保藏菌种容易被污染或产生变异D．对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4℃保藏的方法D3．将酵母菌菌种从菌种试管接种到另一支试管的操作，下列说法有误的一项是（）A．整个接种过程都要在酒精灯的火焰附近进行B．接种环放在酒精灯火焰上灼烧之后即可伸入菌种试管挑取少许菌种C．菌种试管口和待接种的试管口接种前后都要通过酒精灯火焰2～3次D．带菌的接种环应在培养基斜面上由底部向上轻轻划“Z”型折线B第一章发酵工程第二节发酵工程的无菌技术（第3课时）酵母菌是单细胞真菌，可以进行出芽生殖，也可以进行孢子生殖。其培养的最适pH为4.5～5.0，最适生长温度一般为28℃～30℃，可以用液体培养基培养，也可以用固体培养基培养，但要获得纯化的酵母菌菌落，则需通过固体培养基培养。思考：如何获得纯化的酵母菌菌落？平板划线法一、平板划线法

阅读课本第21页的内容，理解平板划线法的概念和原理，并初步认识平板划线法的操作方法。学生活动一、平板划线法把含有多种微生物的杂菌样品，通过在特定的琼脂平板表面划线稀释，从而获得_________的方法。

将微生物样品在琼脂平板表面多次做___________的稀释划线，经过这样的操作可得到________________________。经过平板培养后，会形成部分__________________________的纯种菌落。1．概念单个菌落“由点到线”较多独立分布的单个微生物由单个微生物生长、繁殖而成2．原理平板划线法分离和培养酵母菌在一个倒有培养基的培养皿的皿底外侧面中央用记号笔画一直线，再在此线中间处画一垂直线，将培养皿分成三个区域：第1区域、第2区域、第3区域，分别标上“1”“2”“3”字样。123接种划线时，将带有酵母菌样品的接种环，在培养皿内培养基的第1区域划线，然后再从第1区域划到第2区域，从第2区域划到第3区域（在第2次、第3次划线前，接种环需过火灭菌）。在固体培养基表面完成多次“由点到线”的逐步稀释。划完线后盖上皿盖，倒置培养。接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行。通过培养可以得到由单个酵母菌增殖而形成的菌落。灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线和第一次的划线相连。（1）五区划线法（2）几种划线方法示意图拓展平板划线的其他方法二、通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落尝试通过平板划线法获得纯化的酵母菌菌落。（一）目的要求（二）实验原理

马铃薯葡萄糖琼脂培养基能满足酵母菌生长、繁殖的营养需要，利用前面实验中配制的马铃薯葡萄糖琼脂培养基制作平板。

平板划线法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培养基平板上，采用无菌操作技术及平板划线法能够获得纯化的酵母菌菌落。酵母菌样本（菌种）；接种环、酒精灯、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅；马铃薯葡萄糖琼脂培养基。（三）实验器材和试剂（四）实验步骤1．培养基和培养皿灭菌使用哪种灭菌方法和设备进行灭菌？用牛皮纸包扎已配制的培养基已包装的培养皿高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌法将灭好菌的培养基和培养皿取出，置于操作台上，待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。2．倒平板①拔出锥形瓶的棉塞。②将瓶口迅速通过火焰。③将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10~20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖。④等培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。操作将灭好菌的培养基和培养皿取出，置于操作台上，待培养基冷却到50℃左右时进行倒平板操作。图1打开瓶塞图2灼烧瓶口灭菌图3倒培养基等平板冷却凝固后，将平板倒置（皿盖在下，皿底在上）备用。在酒精灯火焰旁一只手拿着装有培养基的锥形瓶，另一只手拔出瓶塞（图1），使瓶口迅速通过火焰2～3次（图2），并转动瓶口，确保瓶口被灭菌。再取无菌培养皿，在火焰旁用拇指和食指将培养皿打开（稍大于锥形瓶瓶口），将锥形瓶中的培养基倒入培养皿中（图3）。

注意事项倒平板的注意事项待培养基冷却到50℃左右时进行倒平板操作。要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰，通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。倒平板时，要用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。1．倒平板时，为什么在酒精灯火焰旁操作？

酒精灯火焰旁是无菌区域，可以避免周围环境中的微生物的污染。2．倒平板时为什么要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3．平板冷凝后为何要倒置？防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快蒸发。易错辨析平板划线法操作的注意事项划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环灭菌，划线操作结束后仍需灼烧接种环。灼烧接种环之后，要等其冷却后才能挑取菌体，以免温度太高杀死菌种。在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。多次划线时最后一区域不要与第一区域相连。接种和划线操作需要在酒精灯火焰附近进行。三区划线示意图培养获得的酵母菌菌落在平板上划线，然后置于28℃恒温箱内培养。3．划线和培养根据实验操作流程进行倒平板和划线。在此过程中注意不到烫伤、划伤，操作要规范。学生活动每次划线前后灼烧接种环的