生物技术 大规模并行测序 第1部分：核酸与文库制备 征求意见稿

GB/TXXXXX—XXXX1生物技术大规模并行测序第1部分：核酸和文库制备ISO20395:2019生物技术核酸靶序列定量方法性能评估要求qPCR和ddPCR[Biotechnology—Requirementsforevaluatingtheperformanceofquantificationmethodsfor3.13.2注：条形码通常位于序条形码通常位于测序接头内（3.1）。3.3注：每个样本都由一个唯一的条形码（3.2）标识，这使得在并行分析过程中能识别出结果。3.4注：多核苷酸中鸟嘌呤和胞嘧啶的含量通常以总含氮碱基的分数(或百分比)3.5GB/TXXXXX—XXXX23.6一套用于制备含有标签的DNA或RNA片段的程序，以及用于大规模并行3.7掺入过程对照spike-inprocesscon在大规模并行测序方案的各个步骤中，样本中通常注：过程对照可以用来评估任何协议步骤，但通常用于文3.84核酸样品质量评价量和质量的要求在MPS方法之间可能有所不同。核酸纯化重分子检测样品质量的其他一般考虑可见ISO21474-4.2样本定量ISO20395：2019,5.2提供了一系列核酸定量方法，其适用于不同MPS应用的最佳样品量和浓度4.3样本纯度核酸样品纯度分析应按照ISO20395：2019,5.4规4,4样本完整性4.4.1概述ISO20395：2019附件B描述了用于凝胶电泳和微流体分析系统可用于评估核酸样本的完整GB/TXXXXX—XXXX34.4.2琼脂糖凝胶电泳4.4.3毛细管凝胶电泳4.4.4微流控分析系统PCR方法可以用于完整性评价，高质量的样注：福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)样品可能会对某些DNA造成挑战，ISO2016MPS文库的质量取决于以下程序，包括但不限于：一些测序方法(例如短读测序)要求模板DNAGB/TXXXXX—XXXX4控制，但是需要大量的输入DNA(微克量)，该方法只适用于小5.2.3酶切化学破碎通常用于分解长RNA片段，化学破所得产物的长度从115个到350个碱基核苷酸不等，且可以通过增加或减少孵育时某些文库制备方案要求对片段化的DNA或RNA进行定量(因为在制备过程中可能损失)。这可以使用4.2中描述的任何方法来完成，但最典型的方法是通5.3.1修复因破碎会引起损伤，所以在这个过程之后应修复b)接头的设计；GB/TXXXXX—XXXX5选择条形码/索引的核苷酸序列应该在测序项目中可条形码的长度应尽可能短，关于这个质量指标的参考，请见条形码/索引的序列通常由6至12bp组成。DNA测序文库中的每个条形码/索引都应该有一个独特的b)距离(每个指数组合之间的基数差)。如果b)用于评估，距离应＞3bp。5.4大小选择5.5扩增5.6纯化和清洗程序5.7文库定量GB/TXXXXX—XXXX6a)文库的大小分布(例如，荧光测定法通常用于选择，但不适用于片段大小分布广的文库)；b)使用的文库制备方法的类型(例如qPCR定量方法通常使用与文库接头结合的引物，因此对于宜进行文库定性以检测潜在的问题，例如高比例的短DNA片段或接头二聚体，并确定它们是否具有实验室宜使用经过验证的方案来获得用于文库制备的特定分子质量范围通过使用磁珠最小化，除非它们主导反应，否则不会构成重大5.8.2方法在积累验证数据之前，应为整个工作流程开发、实或错误的方法步骤。细胞系、DNA/基因组片7.2对照样品GB/TXXXXX—XXXX7b)具有良好表征的DNA/基因组片段；宜确定、实施和记录长期监测质量的阳性对在样品制备过程中可以使用阴性对照，在一些应用中，如靶向测序/基因富集，特定的DNA或RNA模并非每次运行都需要阴性对照，应建立、实施和记录使用阴性对照监测果在内参对照中观察到序列错误，则在主样本可能都发生在高浓度(>1%)下，内参对照可用于一些短读测序平台，以提高低多样性文库中的序列多样7.7参考资料GB/TXXXXX—XXXX88.2初步样本评估8.3协议和操作程序或核酸库之间的交叉污染。运行性能可以通过分析质量控GB/TXXXXX—XXXX9b)DNA分离采用了哪些方法?分离方法是否能正确去除盐类或洗涤剂？GB/TXXXXX—XXXX表B.1提供截至2020年8月1日与已知全球MPS平台相关的质量指标标准的信息，表B.2提供适合不围10µg200ng/µl—IonS5TM,210µg200ng/µl—10µg200ng/µl—Nanopore4PromethION®51µg200ng/µl——PacBio®3µg200ng/µl——1illumina®是illumina生物技术公司一个商标。本信息是为了3MGI是华大智造科技股份有限公司的商标。本信息是为了方便文件的使用者而提供的，不构成ISO对命名产5OxfordNanoporePromethION®是牛津Nanopore科技有限公司的商标。本信息是为了方便文件的使用者而提供的，不构成6PacBioSequelII®是PacBio生物科学生物技术公司的商标。本信息是为了方便文件的使用者而提供的，不构成ISO对命名产品7PacificBiosciences是用零模波导(ZMWsGB/TXXXXX—XXXX200ng/µl200ng/µl200ng/µl1000ng/µl5ng/µl200ng/µla样品数量和样品浓度来自几个国际实验室。用户可以与测序实验室或公司进行查询，以获得最新的准bQ129/41试验可取250ng。然而，保存时间越长测序质量越差。GB/TXXXXX—XXXX参考资料一览表见表C.1。清单不包括所有参考材料，该列表并不包括所有的参考资料。实验室/—NISTaRM8393-用于全基因组变异评估的人类DNA(中国血统之—NISTaRM8398-用于全基因组变异评估的人类DNA(犹他/欧洲血—NIFDCbYJ-360007c—NISTaSRM2373-用于HER2测量的基因组DNA标准—NISTaRM8366-用于癌症测量的EGFR和RNA插入的DNA模板—NISTaSRM2374-用外源RNA—NMIJcCRM-6204-用于定量分析的CRM-6204-核糖核酸(RNA)溶液—NISTaRM8375-用于测序性能评估的微生物基因组DNA标准—NISTaM8376-微生物病原体DNA的检测和鉴定标准—NIFDCbYJ-360008c—NIFDCbYJ-360010cGB/TXXXXX—XXXXf[2]ISO21474-1：2020,acids—Pa