生物化学与分子生物学 蛋白质结构与功能 学习资料

104第一篇

生物大分子的结构与功能基因工程研究所生物大分子？特点：分子量较大（>104），结构复杂定义：由一定的基本结构单位按一定的顺序和方式连接而成的多聚体种类：蛋白质、核酸、聚糖、聚脂第一章蛋白质的结构与功能StructureandFunctionofProtein什么是蛋白质?蛋白质(protein，Pr)是由许多氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。

早在1938年瑞典科学家J.J.Berzelius就预见到蛋白质在生命科学中的重要性，他建议命名蛋白质为Protein。Protein源自希腊字Proteios，意为第一、最初、首要，可见蛋白质的重要性。蛋白质是生命活动的物质基础含量多：

湿重：约占体重的17－22%；干重：约占细胞干重45%种类多：

一个大肠杆菌：＞3000种一个真核细胞：数千种

人体内蛋白质：＞10万种

生物界：约1百亿种分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质1）作为生物催化剂:酶2）代谢调节作用:激素、生长因子3）免疫保护作用:免疫球蛋白4）物质的转运和存储:血红蛋白、血浆脂蛋白5）运动与支持作用:肌肉蛋白6）参与细胞间信息传递:G蛋白特殊生物学功能氧化供能参与构成各种细胞及组织功能多：蛋白质是生命活动的执行者蛋白质结构与功能

蛋白质的分子组成1

蛋白质的分子结构2

蛋白质结构与功能的关系3

蛋白质的理化性质4

蛋白质的分离纯化与结构分析5TheMolecularComponentsofProtein第一节蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成主要有C、H、O、N和S,其次有少量的P,Fe,Cu,Zn,Mn,I,…

。

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％

含氮量的测定:

凯氏定氮法

蛋白质元素组成的特点100gPr含氮16gPr克数=样品中含氮克数×6.251g氮=6.25gPr[原理]

①消化：含氮的有机物(除硝基外)与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨；氨进一步与过量的硫酸作用，生成硫酸铵；②蒸馏：加强碱碱化，可使消化液中的硫酸铵分解，放出氨；③

吸收：可用水蒸汽将产生的氨蒸馏到过量的硼酸标准溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低；④

滴定：用标准无机酸滴定硼酸溶液，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氮原子的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。

以甘氨酸为例的凯氏定氮法反应过程：①消化：为使消化过程快速彻底地进行，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂。

CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2↑

+3SO2↑

+4H2O+NH3↑2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4②蒸馏：(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2H2O+2NH3↑③吸收：NH3+HBO2→NH4BO2

（H3BO3→

HBO2+H2O）④滴定：

NH4BO2+HCl→HBO2+NH4Cl凯氏定氮仪三聚氰胺(C3H6N6)“三鹿奶粉事件”二、氨基酸(aminoacids,

aa)

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但参与蛋白质合成的氨基酸仅有20种，且均属L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。H甘氨酸CH3丙氨酸L-α-氨基酸的通式Rα1.α碳原子上都有一个α-氨基和一个α-羧基∴它们都属于α-氨基酸。

2.除甘氨酸外,α碳原子均为手性碳原子∴每一种aa有两种构型：D-型和L-型。组成天然蛋白质的20种aa，都属L-型aa。参与蛋白质合成的20种aa的共同特点:非极性脂肪族氨基酸(6种)极性中性氨基酸(6种)芳香族氨基酸(3种)酸性氨基酸(2种)碱性氨基酸(3种)三、氨基酸的分类（按侧链）(一)非极性脂肪族氨基酸(二)极性中性氨基酸(三)芳香族氨基酸苯基吲哚基酚基tyrtrp(四)酸性氨基酸(五)碱性氨基酸咪唑基胍基

20种氨基酸的名称及缩写代号根据侧链R基团的结构根据侧链R基团的酸碱性酸性aa碱性aa中性aa脂肪族aa芳香族aa杂环aa杂环亚aa其他分类方法几种特殊氨基酸

脯氨酸唯一亚氨基酸甘氨酸唯一非L-氨基酸H-CHCOO-

+NH3含硫氨基酸：蛋氨酸(又名甲硫氨酸）、半胱氨酸含巯基的氨基酸：半胱氨酸含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸1.不存在Pr分子中，常以游离形式存在的氨基酸，如瓜氨酸，鸟氨酸，同型半胱氨酸等2.没有遗传密码却出现在Pr分子中的氨基酸，羟脯氨酸，羟赖氨酸，胱氨酸等非编码氨基酸定义：参与Pr合成的20种氨基酸,又称标准氨基酸

特点：有各自的遗传密码；无种属特异性编码氨基酸+胱氨酸二硫键-HH四、氨基酸的理化性质1.两性解离及等电点氨基酸是两性电解质，其解离方式取决于所处溶液的酸碱度。

等电点(isoelectricpoint,pI)

氨基酸分子所带正、负电荷相等时，溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子阳离子阴离子氨基酸等电点（PI）的计算中性氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2)

酸性氨基酸：pI=1/2（pK1+pK2)

碱性氨基酸：pI=1/2（pK2+pK3)等于兼性离子两边pK值的平均值+H++H+K1K2A0A+A-中性氨基酸pI计算pI=1/2（pK1+pK2）+H++H++H+K1K2K3A+A0A-A2-2.093.869.82pI=(2.09+3.86)/2=2.97酸性氨基酸pI计算pI=1/2（pK1+pK2)K1K2K3A2+A+A0A-+H++H++H+2.188.9510.53pI=(8.95+10.53)/2=9.74碱性氨基酸pI计算pI=1/2（pK2+pK3)两性解离及等电点应用：1.电泳分离氨基酸2.离子交换树脂分离氨基酸例：有一混合氨基酸溶液，各种氨基酸的pI为4.6；5.0；5.3；6.7；7.3。电泳时欲使其中4种泳向正极，缓冲液的pH应该是：A．4.2B.

5.2C.

6.2D.

7.2E.

8.22.紫外吸收芳香族aa分子中有共轭双键而对紫外光有吸收作用，最大吸收峰在280nm

附近，且光吸收强度与aa浓度成正比。芳香族氨基酸的紫外吸收苯丙氨酸应用：Pr的定量测定3.茚三酮反应

氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。应用：法医学上，用于采集犯罪现场留下来的指纹氨基酸的用途1.精氨酸：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果；2.天冬氨酸：钾镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。3.半胱氨酸：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等；4.组氨酸：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。1、在医学上的应用2、食品工业上的应用1.营养强化剂；2.谷氨酸钠－味精；3.天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口；4.天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：－甜味素APM五、肽(peptide)*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的

-羧基与另一个氨基酸的

-氨基脱水缩合而形成的酰胺键。（一）肽+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。两分子氨基酸缩合形成二肽三分子氨基酸缩合则形成三肽……由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)

。由十个以上更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。*多肽是链状化合物，故又称多肽链(polypeptidechain)

*多肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。N端（氨基末端）：多肽链中有自由氨基的一端C端（羧基末端）：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端多肽链有方向性：N端C端N端C端牛核糖核酸酶书写：可用略号，N端写于左侧，用H-或H2N-做标记，C端于右侧用-COOH或-OH表示。命名：简单命名,甘异缬××××肽详细命名为××酰××酰……××酸。肽链中氨基酸残基顺序的书写及命名蛋白质和多肽两词没有严格的界限，它们都是氨基酸的多聚物，许多场合常常混为一谈。通常把由39个aa残基组成的促肾上腺皮质激素（ACTH）作为多肽，而把51个aa残基的胰岛素归属Pr，这就是习惯上的多肽与Pr的分界线。多肽和蛋白质的关系（二）几种生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)γαβ

γ-羧基GSH过氧化物酶H2O22GSH

2H2OGSSG

GSH还原酶NADPH+H+NADP+GSH与GSSG（氧化型谷胱甘肽）间的转换

GSH的功能保护功能：GSH的巯基具有还原性，是细胞内重要的还原剂，可保护结构蛋白或功能蛋白中的-SH不被氧化，从而保护蛋白质的生物学活性解毒功能：-SH本身负电性强，亲核性大。故可与亲电子的毒物如致癌剂和药物结合，从而避免这些毒物和DNA、RNA、Pr结合，保证DNA、RNA、Pr功能不受影响。抗氧化作用：还原细胞内产生的H2O2

，避免细胞受损

体内许多激素属寡肽或多肽

神经肽：脑啡肽、内啡肽2.多肽类激素及神经肽

小结蛋白质的生物重要性蛋白质的元素组成:C、H、O、N（16%）、S

凯氏定氮法测蛋白质含量组成蛋白质的基本单位是20种L-a氨基酸（甘氨酸除外）氨基酸的分类（5类）:结构、三字符号氨基酸的性质：两性解离与等电点、紫外吸收（280nm）、茚三酮反应肽及相关的概念氨基酸残基生物活性肽：GSH更正：主编“李安”应为“李凌”！TheMolecularStructureofProtein

第二节蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构空间构象构象与构型有何差别？构象（conformation):

即空间构象或立体结构，指分子中原子或基团在三维空间的取向和定位，也就是三维结构。构象的改变不涉及共价键的改变，也没有光学活性的改变。构型（configuration)：

指原子在分子中呈光学不对称排布的一种立体结构。构型有两种，即D型和L型，只有分子的共价键断裂，才能使一种构型变成另一种构型。

肽键二硫键氢键盐键疏水键范德华力主键包括共价键非共价键（次级键）蛋白质分子中的化学键

副键（vandewaals）d稳定蛋白质构象的化学键d范德华力氢键疏水键范德华力离子键二硫键稳定蛋白质构象的化学键定义:

蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸从N-端至C-端的排列顺序。一、蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是由遗传信息来决定的1953年Sanger阐明了其一级结构胰岛素维持蛋白质一级结构的主要化学键:主要是肽键，另外还有二硫键欧洲分子生物学实验室EMBL

TheEuropean

Molecular

BiologyLaboratory)于1974年由欧洲14个国家加上亚洲的以色列共同发起建立，包括一个位于德国Heidelberg的核心实验室，及三个位于德国Hamburg，法国Grenoble及英国Hinxton的研究分部。由于具有开放和创新的良好学术氛围，EMBL已发展成欧洲最重要和最核心的分子生物学基础研究和教育培训机构。

EMBL-DNA数据库于1982年由EMBL建立，与美国的GenBank及日本的DDBJ共同组成全球性的国际DNA数据库，近年来发展很快，在1995年数据量成倍递增。EBI是EMBL在英国Hinxton的分部，主要负责建立EMBL－DNA数据库，可进行核苷酸序列检索及序列相似性查询。

GenBank简介GenBank包含所有已知的核苷酸及蛋白质序列、以及与之相关的生物学信息和参考文献，是美国生物技术信息中心（NCBI）建立并维护的，是世界上的权威序列数据库。数据库序列的来源为作者直接递交或间接查寻文献所得，并与世界上其他公开发行的数据库，如EMBL，DDBJ交换每日更新的数据。GenBank发展极为迅速，仅1995年一年里增加的序列数据量，即超过以往14年的累加数目。1995年的90.0版本含有492,483个不同的序列，总长度超过353,713,490个碱基。GenBank每条数据包含对序列的精确描述，序列来源生物的科学名称及树状分类，以及特征数据栏，提供序列的蛋白编码区和具有特殊生物学意义的位点，如转录单位(transcriptionunits)、突变或修饰位点(sitesofmutationsormodifications)及重复序列(repeats），还提供特定序列编码的蛋白质序列。二、蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

特点：1.局部或某一段肽链2.主链构象（-N-C-C-N-C-C-)3.不含侧链（R）的构象*主链骨架：NCCNCCNCC…*侧链：肽链中aa残基中的R基团

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋

(

-helix)

-折叠

(

-pleatedsheet)

-转角

(

-turn)卷曲

(coil)

主要的化学键：氢键

（一）肽单元肽键-CO-NH-中的四个原子和它相邻的两个α-碳原子位于同一平面，构成了所谓的肽单元(peptideunit)

，也称为酰胺平面或肽键平面。1、肽单元中的N-C键具有部分双键性质，不能自由旋转。2、肽键中的N-C键具有双键性质，就会有顺反不同的立体异构，已证实为反式构型。3、C-C

和N-C

是单键，可自由旋转，也正由于这两个单键的自由旋转角度，决定了相邻肽单元之间的相对空间位置。肽单元的主要内容

-螺旋：多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的右手螺旋结构。左手螺旋右手螺旋

（二）

-螺旋（

-helix）LPauling（1901－－1994）TheNobelPrizeinChemistry(1954),“forhisresearchintothenatureofthechemicalbondanditsapplicationtotheelucidationofthestructureofcomplexsubstances”TheNobelPeacePrize(1962)路透社在报道鲍林逝世的消息时却说,他是“20世纪最受尊敬和最受嘲弄的科学家之一”特点：（1）右手螺旋（2）3.6残基/螺旋螺距0.54nm

（3）维持键：氢键（4）R基在螺旋外侧

-螺旋结构角蛋白Keratin广泛存在于动物的毛发、甲、角、鳞和羽等，角蛋白中主要的是

-角蛋白。

-角蛋白主要由

-螺旋构象的多肽链组成。一般是由三条右手

-螺旋肽链形成一个原纤维，原纤维的肽链之间有二硫键交联以维持其稳定性。卷发的生化原理（三）

-折叠（

-pleatedsheet

）

两段或两段以上折叠成锯齿状的多肽链通过氢键相连进而形成较伸展的片层结构。⑴肽键平面折叠成锯齿状（折纸状），R基交错位于齿状结构上下方⑵氢键维持稳定，与主链长轴垂直⑶两条以上肽链并列时，

-折叠有特点：顺向反向平行β-折叠：平行式和反平行式-折叠结构丝蛋白是典型的反平行式折叠，多肽链呈锯齿状折叠构象。丝蛋白(fibroin)α-螺旋和

-折叠结构比较区别点

α-螺旋

-折叠形状氢键R－基团延伸性举例α-螺旋和

-折叠结构比较区别点

α-螺旋

-折叠形状螺旋状锯齿状氢键链内，与长轴平行链间，与长轴垂直R－基团较大较小延伸性较大较小举例毛发角蛋白蚕丝蛋白（四）

-转角和无规卷曲

-转角：是多肽链180°回折部分所形成的一种二级结构。无规卷曲：是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。无规卷曲结构

serineproteinaseinhibitorseaanemonetoxinEGF-likedomaininsulincomplementC-moduledomainsnaketoxin

限制性内切核酸酶BamHI的三级结构

-转角

-折叠无规卷曲

-螺旋

氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成

-螺旋或β-折叠，它就会出现相应的二级结构。1）氨基酸侧链所带的电荷

——同性相斥，异性相吸；2）侧链的大小：侧链大不易形成；3）侧链的形状：脯氨酸不能形成1、影响α-螺旋形成的因素：2、影响β-折叠形成的因素：要求侧链较小（五）超二级结构、模体和结构域在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个有规则的二级结构组合，被称为超二级结构。1.超二级结构二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，称为模体(motif)

，也译为模序或基序。模体是具有特殊功能的超二级结构2.模体(motif)

钙结合蛋白中结合钙离子的模体锌指结构模体常见的形式Zincfinger是一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构。由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn2+构成，形成的结构像手指状。纤连蛋白分子的结构域

结构域是位于超二级结构和三级结构间的一个层次，通常都是几个超二级结构单元的组合，各有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。3.结构域(domain)

三、蛋白质的三级结构整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）定义

N端C端肌红蛋白（myoglobin,Mb）肌红蛋白（myoglobin,Mb）存在部位：心肌、骨骼肌功能：为肌细胞转运和贮存氧组成：

153aa的单肽链＋血红素结构：球状蛋白

疏水键：数量最多 盐键氢键 范德华力此外，某些Pr还有二硫键参与稳定三级结构维持三级结构的化学键主要靠次级键二硫键（二）分子伴侣分子伴侣(chaperon)是一类能介导蛋白质进行正确折叠的蛋白质。*可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合，防止错误折叠。*与错误聚集的肽段结合，诱导其正确折叠。*对蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起重要的作用。伴侣蛋白在蛋白质折叠中的作用分子伴侣是一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象。原核真核均有，类型多种，分多个家族，作用时需ATP供能。不同分子伴侣功能不尽相同：促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠或组装。防止新生多肽链或待组装的蛋白亚基非正常聚集，避免形成无功能的结构（非正确折叠或组装的大分子结构对细胞通常是有害的）帮助修复非正确折叠的蛋白质参与蛋白质跨膜转运辅助蛋白质的降解人体内分子伴侣主要见于内质网，包括：Generalchaperones:BiP,GRP94,GRP170.Lectin（凝集素）chaperones:calnexin（钙联结蛋白）andcalreticulin（钙网织蛋白）Non-classicalmolecularchaperones:HSP47andERp29

Foldingchaperones:Proteindisulfideisomerase(PDI)Peptidylprolylcis-trans-isomerase(PPI)ERp57

原核分子伴侣Hsp60(GroEL/GroEScomplexinE.coli)Hsp70(DnaKinE.coli)Hsp90(HtpGinE.coli)Hsp100(ClpfamilyinE.coli)大肠杆菌中的HSP70反应循环伴侣素的主要作用：为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。

伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程四、蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。亚基之间的结合力主要是氢键和离子键由多个亚基组成的蛋白质四级结构中，若亚基分子结构相同，称之为同聚体，若亚基分子结构不同，则称之为异聚体。

含有四级结构的蛋白质，单独的亚基一般没有生物学功能，只有完整的四级结构才有生物学功能。

由一条肽链形成的Pr只有一、二和三级结构，由两条或两条以上多肽链形成的Pr才可能有四级结构。没有四级结构的蛋白质：1）只含一条多肽链的Pr，如肌红蛋白。2）虽含几条多肽链但借助共价键相连的Pr，如胰岛素。血红蛋白的一、二、三、四级结构血红蛋白的一、二、三、四级结构蛋白质结构要点定义化学键类型一级多肽链中氨基酸排列顺序肽键二硫键二级某一段肽链的局部空间结构氢键

-螺旋

-折叠

-转角无规卷曲三级整条肽链中全部原子的空间位置次级键四级各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用次级键蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次

一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）

↓

二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）

↓

超二级结构（模体）（相邻二级结构的聚集体）

↓

结构域（在空间上可明显区分的相对独立的区域性结构）

↓

三级结构（蛋白质中所有原子在空间的相对位置）

↓

四级结构（亚基聚合体）

五、蛋白质的分类

*根据蛋白质组成成分

单纯蛋白质结合蛋白质

=蛋白质部分+非蛋白质部分*根据蛋白质形状

纤维状蛋白质：难溶于水，如胶原蛋白球状蛋白质：溶于水，如酶、免疫球蛋白辅基分类辅基举例脂蛋白脂类血浆脂蛋白（VLDL、LDL、HDL等）糖蛋白糖基或糖链胶原蛋白、纤连蛋白等核蛋白核酸核糖体磷蛋白磷酸基团酪蛋白（casein）血红素蛋白血红素（铁卟啉）血红蛋白、细胞色素c黄素蛋白黄素核苷酸（FAD、FMN）琥珀酸脱氢酶金属蛋白铁铁蛋白锌乙醇脱氢酶钙钙调蛋白锰丙酮酸羧化酶铜细胞色素氧化酶结合蛋白质及其辅基

ProteinStructure-functionRelationships第三节蛋白质结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础

一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础

举例：牛核糖核酸酶的变性复性实验二硫键

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性

一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。分子伴侣1）破坏非共价键（特别是氢键）的试剂：尿素，盐酸胍。2）破坏（还原）二硫键的试剂：β-巯基乙醇，巯基乙酸、过甲酸、二硫苏糖醇，二硫赤藓糖醇。破坏蛋白质高级结构的试剂（一)一级结构与功能的关系2.一级结构相似，其功能也相似（二）一级结构是功能的基础

一级结构不同，生物学功能各异如：血红蛋白与胰岛素3.一级结构中非“关键”部分改变，功能不变如：胰岛素如：镰刀形贫血4.一级结构中“关键”部分改变，生物活性也改变，引起疾病如：细胞色素C同源性比较胰岛素氨基酸残基差异部分A5A6A10B30人ThrSerIleThr猪ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla马ThrSerIleAla

由同一基因进化而来，具有相似结构相似功能的一类蛋白质，称为同源蛋白质。组成：一条肽链（含104个氨基酸残基）+铁卟啉作用：传递电子，即Fe3++eFe2+目前已测定了近百种生物的细胞色素C的氨基酸顺序，发现由于种属遗传差异，其一级结构有较大的不同。

但有35个不变aa残基，对维持细胞色素C的分子构象和传递电子的功能是必需的。

细胞色素C研究氨基酸序列可以阐明生命进化史，氨基酸序列的相似性越大，物种之间的进化关系越近。几种生物和人的细胞色素C的氨基酸组成的差异38向日葵27果蝇12马1猕猴0黑猩猩与组成人的细胞色素C的氨基酸的差别生物名称镰刀形贫血（Sickle-cellofanemia）正常细胞镰刀形细胞镰刀状贫血—血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。镰刀形贫血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。

由于缬氨酸上的非极性基团与相邻非极性基团间在疏水力作用下相互靠拢，并引发所在链扭曲为束状，整个蛋白质由球状变为镰刀形，与氧结合功能丧失，可以致病人窒息甚至死亡。

谷A（极性）缬A（非极性）二、蛋白质空间结构与功能的关系

蛋白质的空间构象是其功能活性的基础（一）

构象在，功能在

核糖核酸酶变性复性实验（二）构象改变，功能变化：

血红蛋白的变构效应（三）构象改变引起疾病：

疯牛病

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性核糖核酸酶变性复性实验（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构

肌红蛋白（Mb－Myoglobin）血红蛋白（Hb－Hemoglobin）共性储氧和供氧均为球状蛋白质均含血红素辅基血红素结构Fe离子六个配位键：4个与吡咯环上的N相连；1个与F螺旋段His的咪唑基相连；1个与O2结合血红素辅基的结构及其氧合部位1.肌红蛋白(Mb)本质：结合Pr：1条多肽链（153个aa残基）分子量：16，700功能：在肌肉中结合氧和储存氧结构：呈紧密球形，水溶性好多肽链分为8个α-螺旋区：A－H2.血红蛋白(Hb)组成：Hb(成年）4条多肽链4分子血红素Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。

2α:141×22β:146×2血红蛋白亚基间盐键示意图Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。（二）血红蛋白的构象变化与结合氧

肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线Mb:直角双曲线Hb:“S”形曲线*协同效应(cooperativity)

蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此蛋白质分子中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。

如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)紧张态（tensestate）难与O2结合松弛态（relaxedstate）易与O2结合O2血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。变构效应(allostericeffect)在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的变构效应，又称别构效应。（三）蛋白质构象改变与疾病

蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨丁顿舞蹈病、疯牛病等。疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成为富含β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病疯牛病(Madcowdisease)正常PrP异常PrP疯牛病简介1985年在英国发现，因其可致牛出现异常神经系统症状，富于攻击性而取名“疯牛病”；尸检脑组织进行病理检查，发现类似于羊瘙痒病的海绵状病变，命名：牛海绵状脑病（bovinespongiformencephalopathy,BSE)疯牛病属于传染性海绵状脑病中的一种。蛋白质结构与功能的关系小结蛋白质空间构象蛋白质一级结构决定结构是功能的基础举例:牛核糖核酸酶的变性、复性实验蛋白质功能决定举例:血红蛋白的变构效应第四节蛋白质的理化性质ThePhysicalandChemicalCharactersofProtein具有氨基酸性质两性电离紫外吸收性质呈色反应具有生物大分子特性

胶体性质沉淀、变性和凝固等一、理化性质

（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。pH=pIpH>pIpH<pI兼性离子

人体蛋白质，pI~5.0在人体体液pH7.4的环境下，带负电荷（二）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（三）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，生成紫红色的蛋白质-Cu2+复合物，此反应称为双缩脲反应。

在双缩脲反应的基础上，生成的蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸酚基与Folin-酚试剂(磷钼酸和磷钨酸化合物)反应，生产蓝色的化合物(钼蓝和钨蓝的混合物)。3.Folin酚试剂法(Lowry’s法)

反应试剂颜色反应基团反应的Pr及AA双缩脲反应

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2个以上肽键所有蛋白质Millon反应

Millon,硝酸，亚硝酸

红色酚基Tyr黄色反应

HNO3及NH3

黄、橘黄

苯基Phe,Tyr乙醛酸反应乙醛酸H2SO4

紫红吲哚Trp坂口反应

次氯酸钠,萘酚红色

胍基ArgFolin酚试剂反应

CuSO4磷钨酸-钼酸

兰色

酚基Tyr茚三酮反应

茚三酮

紫兰色

游离氨、羧基Pro和羟Pro呈黄色（三）蛋白质的呈色反应（四）蛋白质的胶体性质

蛋白质分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素:

水化膜颗粒表面电荷+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉去水化膜，去电荷（五）蛋白质的变性、沉淀和凝固

在某些物理和化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。*蛋白质的变性(denaturation)

概念

吴宪教授1931年：“天然蛋白质分子借助次级键连接而成一种紧密、有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。“StudiesonDenaturationofProteins.XⅢ．ATheoryofDenaturation.ChinesejournalofPhysiology，1931，5(4)：321～344”。蛋白质研究领域内国际上最具有权威的综述性丛书《AdvancesinProteinChemistry》第47卷（1995年）发表了美国哈佛大学教授、蛋白质研究的老前辈J.T.Eddsall的文章“吴宪与第一个蛋白质变性理论（1931）HsienWuandthefirstTheoryofProteinDenaturation(1931)”，对吴宪教授的学术成就给予了极高的评价。该卷还重新刊登了吴宪教授六十四年前关于蛋白质变性的论文。一篇在1931年发表的论文居然在1995年仍然值得在第一流的丛书上重新全文刊登，不能不说是国际科学界的一件极为罕见的大事。蛋白质变性理论

造成变性的因素

1）物理因素：高温、高压、脱水、射线等

2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐、生物碱试剂、尿素等

变性的本质——破坏蛋白质空间结构（非共价键和二硫键），不改变蛋白质的一级结构（肽键、分子组成、分子量不变）。变性后的表现：生物活性丧失理化性质改变溶解度降低粘度增加结晶能力消失易被蛋白酶水解②防止变性：低温保存生物制品

应用举例

①利用变性：酒精消毒、高压灭菌③取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)变性与复性(renaturation)

变性可逆变性：Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学活性还能恢复。不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构象变化大，理化性质难以恢复。复性在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。凡是能消除蛋白质表面的水化膜并中和电荷的试剂均可以引起蛋白质的沉淀。常用的有中性盐、有机溶剂、某些生物碱试剂、某些酸类及重金属盐类等。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质沉淀蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。所以凝固的蛋白质一定变性、沉淀。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)

蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

变性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定变性变性/沉淀的Pr不一定凝固凝固的Pr则一定变性、沉淀变性、沉淀、凝固

变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。变性物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等沉淀改变pH至pI破坏水溶液中蛋白质的水化膜和中和电荷（变性蛋白质）（蛋白质未变性）凝固加热（变性，不再溶解）变性不一定沉淀沉淀不一定变性凝固则一定变性、沉淀加热第五节蛋白质的分离纯化与结构分析TheSeparationandPurificationandStructureAnalysisofProtein分离纯化蛋白质的一般程序材料的预处理及细胞破碎通常选择适当的缓冲液抽提蛋白质蛋白质粗制品的获得进一步分离纯化获得蛋白纯品提取*蛋白质的分离和纯化的依据

溶解度分子大小电荷吸附性质等———蛋白质理化性质的差异

蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质常用的纯化方法分子质量透析、超滤凝胶层析离心溶解度调整pH调整离子强度降低介电常数电荷电泳等电聚焦离子交换层析特异结合性质亲和层析其他性质吸附层析液相层析气相层析一、透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。人工肾血液透析图超滤（ultrafiltration）在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。磁力搅拌器待超滤的蛋白质溶液加压的氮气超滤膜

盐析法有机溶剂沉淀法免疫沉淀法二、沉淀（precipitation）

盐析法定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。原理:

破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等优点：Pr不变性，常用试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂原理：与H2O结合，破坏水化层优点：分辨率优于盐析法，能使某一Pr在狭小有机溶剂浓度范围内沉淀。缺点：易使Pr变性应用：pI沉淀Pr。调节溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破坏水化膜，Pr沉淀。注意：防止Pr在分离过程中发生变性：①0－4℃下进行；②有机溶剂浓度不能太高，Pr沉淀后立即分离有机溶剂沉淀法*免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。免疫沉淀法：三、

电泳（electrophoresis）

定义：带电粒子在电场中向着与其电性相反的电极移动的现象。Pr分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的泳动速度也不同，由此可彼此分离。几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS)

常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳蛋白质组学研究的重要技术。

SDS等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF）

+(H2SO4)

(NaOH)pH3pH10

+(H2SO4)

(NaOH)pI4.55.16.07.98.1pH3pH10等电聚胶电泳双向电泳（twodimensionalelectrophoresis）IEFSDS双向电泳（twodimensionalelectrophoresis）四、层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。*凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。离子交换层析凝胶过滤大分子先洗脱下来小分子后洗脱下来五、超速离心(ultracentrifugation)*利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同的物质进行分离*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示。因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故应用超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质的分离纯化：小结1、透析、超滤根据性质：分子大小2、盐析根据性质：蛋白质的沉淀作用机理：中性盐中和表面电荷，破坏水化层影响因素：表面电荷、水化层、溶剂性质3、电泳：根据性质：蛋白质的两性解离作用机理：异性电荷互相吸引影响因素：电荷种类及数量、分子大小及形状溶液离子强度及pH等4、层析（1）离子交换层析：电荷、分子量、分子形状（2）亲和层析：生物特性（3）吸附层析：吸附特性（4）凝胶过滤层析（分子筛）：分子大小及形状大分子先洗脱下来5、超速离心：分子大小及形状、溶液特性六、多肽链中氨基酸序列分析分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。COOHH2NCN

CN

CN

C

N分析残基组成Edman