重组DNA技术的基本工具（教学课件）高二生物（人教版2019选择性必修3）

第三章

基因工程第1节

重组DNA技术的基本工具【本节聚焦】1.重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？2.基因工程载体需要具备什么条件？科技探索之路：基因工程的诞生和发展1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。思考：如何培育出抵御番木瓜环斑病毒的木瓜呢?杂交育种？同种生物之间进行诱变育种？在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因不定向科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？一、基因工程的概述1.基因工程的概念：指按照人们的愿望,进行严格的设计并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。【归纳定义】工程别名：操作对象：操作水平：

工程实质：DNA重组技术基因DNA分子水平基因重组一、基因工程的概述2.图解“基因工程实质”转移A生物B生物萤火虫普通动植物发光基因一、基因工程的概述【问题1】为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。③都遵循碱基互补配对原则脱氧核糖含氮碱基磷酸DNA平面结构DNA立体结构一、基因工程的概述【问题2】为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。一、基因工程的概述思考：

DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。“分子手术刀”准确切割DNA分子“分子缝合针”“分子运输车”将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

能识别

的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称

。限制酶1.来源：2.种类：主要来自原核生物数千种限制酶不是一种酶，而是一类酶。3.作用特点：专一性作用部位一般为4~8个或其他数量的核苷酸，最常见的为6个核苷酸。双链DNA分子二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”【问题3】

你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”1’2’3’4’5’

G限制酶1’2’3’4’5’

A磷酸二酯键TGCCGTAA5'3'5'3'二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”4.识别序列EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’限制酶所识别的序列的特点是：

呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”拓展——限制酶的命名：阅读72页资料卡“限制酶的命名”，说说EcoRⅠ各个字母的代表含义。EcoRⅠ属名Escherichia首字母种名coli前两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”（1）实例1——EcoRⅠ限制酶切割

*EcoRⅠ识别序列为GAATTC*EcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键黏性末端黏性末端（2）实例2——SmaⅠ限制酶切割*SmaⅠ识别序列为CCCGGG*SmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键平末端5.切割结果:DNA两条单链的切口处，伸出几个核苷酸，刚好能互补配对，这样的切口叫黏性末端。切口处是平整的，这样的切口叫平末端。课堂练习1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________

GATCAATTAGCTGATC思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。（比如BamHⅠ、BglⅡ）不能，限制酶只能识别并切开双链DNA分子。（2）限制酶切一次可断开

个磷酸二酯键，产生

个游离的磷酸基团，产生

个黏性末端。要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？222（1）限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？2.请结合限制酶的作用特点，回答以下问题：要切2个切口，产生4个黏性(平)末端。课堂练习用同种限制酶切割(EcoRⅠ)TGAATTCGACTTAAGCAGAATTCTTCTTAAGA缺口怎么办只能用同种酶切割吗？完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。DNA连接酶—“分子缝合针”恢复被限制酶切开的磷酸二酯键3.把两种来源不同的DNA分子进行拼接，应该怎样处理呢？课堂练习三、DNA连接酶——“分子缝合针”2.作用：将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。5′3′TACGTACTGAAT5′3′5′3′CGCGCG5′3′CGCGCG切口切口切口CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG将两个双链DNA片段“连接”起来的酶1.概念：注意：1、DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA!2、DNA连接酶作用没有特异性。三、DNA连接酶——“分子缝合针”5′5′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′5′5′5′5′T4DNA连接酶T4DNA连接酶E.coliDNA连接酶3.种类：⑴E.coliDNA连接酶：⑵T4DNA连接酶：只能连接具有互补黏性末端的DNA片段(1)可以连接具有互补黏性末端的DNA片段(2)可以连接平末端，但效率相对较低DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？三、DNA连接酶——“分子缝合针”旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？DNA聚合酶相同点：不同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板；DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。三、DNA连接酶——“分子缝合针”项目DNA连接酶限制酶DNA聚合酶解旋酶DNA酶作用部位作用对象作用结果磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键氢键DNA片段DNA单个的脱氧核苷酸DNADNA将两个DNA片段连接成完整的DNA分子切割双链DNA分子将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端将双链DNA分子局部解旋为单链DNA连接酶、限制酶、DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较课堂练习1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的B.②片段是在识别序列为

的限制酶作用下形成的C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键√①和④相同DNA连接酶课堂练习2.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端√磷酸二酯键DNA片段T4DNA连接酶能连接平末端四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”质粒将外源基因送入受体细胞,

在受体细胞内对目的基因进行大量复制.

1.作用：动植物病毒噬菌体2.种类：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.运载体需具备的条件：条件①：具有一个或多个限制酶切割位点；条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。条件④：对受体细胞无害。问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？问题1：载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？供外源基因插入其中使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。不能被酶切破坏便于重组DNA筛选与鉴定DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制有切割位点（酶切位点）4.最常用的载体——质粒：真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过

改造的。人工终止子:

转录的终点，在转录过程中起调控作用。终止子:

转录的终点，在转录过程中起调控作用。质粒DNA分子质量一般为拟核的0.5%~3%四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：拓展延伸：标记基因的筛选原理四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

思考·讨论：

请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI

的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。…TATCGTACGATAGGTACTTAA…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?

如果不能，可能是什么原因造成的？

如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？不能。因为基因的长度一般在100个碱基对以上。课堂练习1.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏_________和_______________________。（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。目的基因质粒上的抗生素抗性基因目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中课堂练习（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。目的基因与目的基因质粒片段与质粒片段反向连接课堂小结限制酶作用部位：种类E.coliDNA连接酶运载工具条件③

有一个至多个限制酶切割位点质粒、噬菌体、动植物病毒DNA连接酶作用部位：切开DNA分子的磷酸二酯键来源：主要存在于原核生物中特点：具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列）T4DNA连接酶①

对受体细胞无害②

能自我复制或整合到宿主DNA上。④

常有特殊的标记基因种类：磷酸二酯键作用结果：产生黏性末端或平末端探究•实践：DNA的粗提取与鉴定一、实验原理00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度

利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精DNA能溶于物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液在一定温度下，DNA被二苯胺试剂染成蓝色初步分离DNA和蛋白质溶解DNA鉴定DNA探究•实践：DNA的粗提取与鉴定DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。1.选材：猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核和线粒体，几乎不含DNA，不适合；鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。二、材料用具

（1）选什么样的材料实验更易成功？（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？探究•实践：DNA的粗提取与鉴定2.试剂：试剂研磨液体积分数为95%的酒精二苯胺2mol/L的NaCl溶液

蒸馏水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鉴定DNA，要现配现用研磨液成分作用SDS使蛋白质变性EDTA抑制DNA酶Tris-HCl缓冲液稳定DNA二、材料用具探究•实践：DNA的粗提取与鉴定三、实验步骤探究•实践：DNA的粗提取与鉴定1.破碎细胞——称取

，切碎，放入研钵，倒入

，

研磨。洋葱研磨液充分三、实验步骤目的：裂解细胞，释放DNA2.过滤——在漏斗中垫上

过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取

；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取

。纱布上清液上清液思考:过滤能否用滤纸代替纱布？

不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。思考:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。探究•实践：DNA的粗提取与鉴定三、实验步骤3.DNA的粗提取——在上清液中加入体积相等的

溶液,静置2~3min，溶液中出现的

就是粗提取的DNA。预冷的酒精白色丝状物思考:此步骤的目的是？使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。预冷的酒精的优点①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。思考：酒精预冷的作用？用冷却的酒精析出DNA探究•实践：DNA的粗提取与鉴定用玻璃棒沿

搅拌，卷起

，并用滤纸吸去上面的水分：或将溶液倒入塑料离心管中离心，取

晾干。一个方向沉淀物丝状物三、实验步骤3.DNA的粗提取——思考：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子析出DNA探究•实践：DNA的粗提取与鉴定三、实验步骤4.DNA的鉴定——实验组对照组水浴加热将丝状物或沉淀物溶于

溶液中，加入

试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min二苯胺2mol/L的NaCl空白对照：

在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。评价结果：（1）DNA纯度看提取物颜色（2）DNA的量看与二苯胺反应颜色的深浅现配现用！探究•实践：DNA的粗提取与鉴定四、结果分析与评价

二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？

观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。探究•实践：DNA的粗提取与鉴定①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成