基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修33

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序课标要求学习目标[课标内容]阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤[核心素养]生命观念：认同抗虫棉的形成过程需要基因工程的四步操作过程,并学会对抗虫棉是否形成进行检测和鉴定科学思维：基于PCR原理,比较分析PCR技术与体内DNA复制的异同点科学探究：结合抗虫棉这一实例,在基因工程中选取恰当的方法,尝试提出初步的构想,进行简单的设计[学习目标]1.阐明基因工程的原理和基本操作程序2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物[学习重点]1.基因工程基本操作程序的四个步骤2.DNA片段的扩增及电泳鉴定[学习难点]1.利用PCR获取和扩增目的基因2.DNA片段的扩增及电泳鉴定课题：基因工程的基本操作程序→目的基因的筛选与获取

——→基因表达载体的构建

——→将目的基因导入受体细胞（转化）

——→目的基因的检测与鉴定操作流程四步曲：与载体拼接

普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉

（有抗虫特性）导入抗虫基因重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定操作流程四步曲：问题探讨第二步：基因表达载体的构建第一步：目的基因的筛选与获取第三步：将目的基因导入受体细胞第四步：目的基因的检测与鉴定探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定问题一

？目的基因的筛选与获取1.目的基因的概念：目的基因：

用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因(即基因工程概念中所指的“符合人们需要的”

）

主要是指编码蛋白质的基因

其次指某些具有调控作用的因子原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游RNA聚合酶识别与结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子结构基因翻译转录mRNA蛋白质原核细胞的基因基因边转录边翻译真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶识别与结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子非编码序列：包括非编码区和内含子结构基因加工转录mRNA前体成熟mRNA外显子内含子翻译蛋白质原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区RNA聚合酶识别并结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞真核细胞不同点编码区是连续的编码区是间隔不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子归纳比较从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选是比较有效的方法2.筛选合适的目的基因明确目标测序等新技术序列数据库（如GenBank）序列比对工具（如BLAST）公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI方法：

①人工合成（包括直接化学合成和逆转录合成）

②构建基因文库获取(P82倒数第二段第一句)

③利用PCR技术扩增目的基因（现在常用）3.目的基因的获取：[视野拓展]人工合成目的基因之逆转录合成法反转录cDNA片段某种生物某个时期的mRNA筛选出目的基因逆（反）转录酶[视野拓展]基因文库获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多_DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，（这个受体菌群）称为基因文库。②基因文库的种类基因组文库：基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）：基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库cDNA文库：用某种生物某发育时期的mRNA进行逆转录得到的cDNA构建的部分基因文库[视野拓展]基因文库（了解）③基因文库的构建多种限制酶切反转录cDNA片段某生物DNA全部提取每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段直接分离法一定范围大小的DNA片段分别与载体连接导入受体菌的群体中储存某种生物某个时期的mRNA基因组文库cDNA文库[视野拓展]基因文库（了解）④基因组文库与cDNA文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库构建基因文库的过程文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性需要内质网和高尔基体上加工完成大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。【思考】结合细胞结构分析真核生物哪种文库里的目的基因更容易在细菌体内得到成功表达？【思考】利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系必修1有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？部分基因文库的目的基因更容易表达因为其内不含内含子，避免了转录后加工的困难。4.利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR：是聚合酶链式反应的缩写。一项根据DNA半保留复制原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR扩增仪PCR技术DNA半保留复制体内复制DNA模板DNA

原料（四种脱氧核苷酸）酶（DNA聚合酶、解旋酶、连接酶）能量（ATP等）引物原理：原料（回忆体内DNA复制的条件）磷酸含氮碱基磷酸含氮碱基OHH5’

1’2’3’4’五碳糖O5’

1’2’3’4’五碳糖OGCATGCAUAGCUAGCT腺嘌呤核糖核苷酸鸟嘌呤核糖核苷酸腺嘌呤脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸胞嘧啶脱氧核糖核苷酸胞嘧啶核糖核苷酸尿嘧啶核糖核苷酸胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸核苷酸的命名脱氧核苷酸核糖核苷酸4种4种3535磷酸二酯键脱水缩合AAGCCA含氮碱基3’5’5’3’聚合脱水缩合核酸结构TTGGTCAAGCCA核酸结构“反向平行双螺旋”5’5’3’3’磷酸端羟基端磷酸端羟基端PCR技术DNA半保留复制体内复制DNA模板DNA

原料（四种脱氧核苷酸）酶（DNA聚合酶、解旋酶、连接酶）能量（ATP等）引物模板DNA；四种脱氧核苷酸；原理：原料（回忆体内DNA复制的条件）dATP与ATP在结构上有什么区别？dATP为什么能用作DNA复制的底物？NTPdNTPddNTPATPdATPddATP[思维提升]

PCR原料dNTP，即脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。其分子结构为：既提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量（①②磷酸键断裂释放能量）★使用引物原因：DNA聚合酶只能从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，延伸DNA链。PCR技术DNA半保留复制体内复制DNA模板DNA

原料（四种脱氧核苷酸）酶（DNA聚合酶、解旋酶、连接酶）能量（ATP等）引物模板DNA；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）缓冲液引物（原因？）原理：原料（回忆体内DNA复制的条件）（另外需要提供温度条件，提供Mg2+作为聚合酶的激活物）体内外引物种类数相同吗？PCR技术一段已知目的基因的核苷酸序列（目的片段两端）前提：（便于确定设计引物）★引物作用：使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸,延伸DNA链（不在两端可采用反向PCR）★使用引物原因：DNA聚合酶只能从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸,延伸DNA链PCR技术过程：变性、复性、延伸三步曲（教材P78图3-5）变性：加热至90℃以上双链DNA解链成为单链DNA

高温取代解旋酶5’3’3’5’PCR技术过程：变性、复性、延伸三步曲（教材P78图3-5）复性：冷却至50℃左右部分两种

“引物”

与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合模板引物5’3’3’5’3’5’5’3’PCR技术过程：变性、复性、延伸三步曲（教材P78图3-5）延伸：升温至72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，根据碱基互补配对原则，合成新的DNA链5’3’3’5’3’5’5’3’PCR技术过程：变性、复性、延伸三步曲（教材P78图3-5）变性复性延伸变性常用琼脂糖凝胶电泳【特别提醒】RNA不能直接PCR(因为RNA不稳定)，只能逆转录成DNA才能PCR（即RT-PCR），重要应用：可用于检测细胞表达情况PCR技术产物鉴定：：以_____方式扩增，

即____（n为扩增循环的次数）指数2n特点PCR应用——新冠病毒核酸检测【联系归纳】PCR与DNA体内复制的比较

PCR扩增DNA复制相同点原理DNA半保留复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、引物、能量（热或ATP）、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内温度较高温度，需要控制温度周期温和条件酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)不需要解旋酶、连接酶细胞内含有的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶引物两种许多种（因为一条链不连续复制）过程先完全解旋再复制（所以不需要连接酶）边解旋边复制连续性连续其中一条链分段不连续结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子（一个细胞周期一次）【讨论】下面两组引物设计可以吗？不可以引物自身不能有回文结构成

（会形成发卡式结构，无法与模板链结合，降低成功率）；两引物间不能互补配对

（降低成功率）两引物碱基比例要一致（保证相同的复兴退火温度提高特异性）[思维提升]引物归纳①需要一段已知目的基因的核苷酸序列，依据它制作2种引物（这个已知片段最好处于目的基因的两端，即要知道目的基因两端序列；如果不在两端采用反向PCR进行）②需要引物的原因：DNA聚合酶不能聚合游离的脱氧核苷酸，只能从引物的3’端开始延伸(即从5’端到3’端延伸)合成DNAPCR需要几种引物？体内外需要的引物种类相同吗？③引物的作用：使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸（延伸DNA链）④引物的本质：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般是RNA片段（起始复制容易出现错配，这样RNA做引物利于DNA复制中准确的检测与修复）⑤PCR的产物要用与构建基因表达载体，所以，引物的5’端应该存在限制酶切点（可以修饰上，对引物3’端要求非常严格，但对于5’端不严格，可以为不同目的进行修饰）⑥引物自身不能有回文结构（会形成发卡式结构，无法与模板链结合）；

两引物间不能互补配对（会降低成功率）⑦两引物碱基比例要一致（保证相同的复兴退火温度提高特异性）⑧引物不能重复利用（所以要根据需要，控制量）⑨引物的长度：用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，影响退火温度和产物特异性PCR特异性扩增某片段，就获取到目的基因50【能力提升】PCR相关数据分析501.需要多少种引物？2.m次循环后不带引物的分子和链分别是多少？两种2m+1-2个3.m次循环需要多少个引物？024.m次循环后只带1个引物的分子和链分别是多少？22m+1-2

引物能够重复利用吗？

利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’第3轮；1/4。5.第几次循环开始出现两条脱氧核苷酸链等长（即只有目的片段的产物）？占产物比是多少第三次6.m次循环后有多少条半链和全链？2

m条和2条7.m次循环后有多少个目的片段？2m-2m个1/4

如图情况呢？第二次1/4

目标片段纯度很高50不能。游离的DNA进入受体细胞，一般会直接被分解，即使可以转录翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？因此，获取Bt基因后，还需要借助载体将其导入棉花细胞，才能使棉花植株获得抗虫特性。基因表达载体的构建问题二

？1.基因表达载体的作用（构建目的）基因表达载体作用：

①使目的基在受体细胞中稳定存在并(复制)遗传给下一代

②同时使目的基因能表达和发挥作用运载体的作用（P72）

①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞中去

②利用它使目的基因复制或整合到受体细胞染色体上同步复制提示：有人采用总DNA注射法进行遗传车转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法将这些DNA导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受受体植物。基因克隆载体目的基因启动子（在基因上游特定的DNA片段，紧挨着转录的起始点，是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动开始转录）终止子（在基因下游，终止转录的特定DNA片段）标记基因（检测目的基因是否导入受体细胞）另外还要有复制原点等多种调控因子2.基因表达载体的组成【讨论】因为细胞一般是进行选择性表达，我们该如何选择哪种启动子、终止子？使用受体细胞自身表达的基因的启动子才能比较有利于基因的表达（如要让其在牛乳中得到产物，就要选择牛乳腺细胞中分泌蛋白基因的启动子）[特别提醒]质粒上标记基因等其它基因都有自身的启动子、终止子，并可以表达（启动子、终止子本就是基因的一部分序列），而目的基因来源途径不一，还需要在受体细胞中表达，所以一般要专门修饰特定启动子目的基因启动子（在基因上游特定的DNA片段，紧挨着转录的起始点，是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动开始转录）终止子（在基因下游，终止转录的特定DNA片段）标记基因（检测目的基因是否导入受体细胞）另外还要有复制原点等多种调控因子选用受体细胞中能选择表达的基因的启动子（成功表达的关键）有时构建诱导型启动子，通过诱导物激活或抑制启动2.基因表达载体的组成目的基因要位于启动子下游，终止子上游3.基因表达载体的构建过程连接酶同种限制酶或产生相同末端的不同限制酶（同尾酶）可以在同一位点插入多种目的基因，做成融合转基因GATC5’3’3’5’GATC①目的基因有没可能与质粒反向连接？或目的基因与质粒各自独立连接成环而对重组效率的影响？讨论你会如何解决这些问题？CGATGGAATCGCCG….GATT…CTAC….酶M酶M酶N酶N【关键】防止反向连接和自我成环双酶切【能力提升】①两种限制酶可以切割出互补的黏性末端，连接后是否能被原来的限制酶切割？（P75拓展应用2（2））酶E酶F——CTTAA——G——ATTAAT————TAATTA————CTTAAG————GAATTC——AATTA——

T——酶E酶F两种酶都不能切割酶M酶N——CCTAG——G——CTAG————GATC————CCTAGG————GGATCC——GATC——

——酶M酶N↓—GGATCC—↓—GATC—酶M酶N可能（1/4）酶M能酶N【能力提升】②两种限制酶可以切割出互补的黏性末端，连接后是否能被原来的限制酶切割？（P75拓展应用2（2））把两个DNA片段连接后,原来的酶切位点可能将不存在,不能被原来的限制酶所识别,有利于保持重组DNA分子的稳定性（如SpeI和XbaI）【思考1】天然的质粒直接用做基因工程载体构建？参照链接的运载体末端序列天然的质粒一般不能全满足作为运载体的全部条件，所以一般需要进行人工改造（P72）【思考2】如果我们得到的目的基因一端是黏末端一端是平末端，可以对平末端修饰个黏末端，那么这个末端的序列如何确定？[特别提醒]①限制酶的选择原则：a.双方都有其识别序列，且能得到相同末端(相同酶或同尾酶)b.质粒上该切点应该位于启动子下游、终止子上游c.不破坏目的基因d.不破坏质粒完整性（即不能同时有一种限制酶的多个切点）e.不破坏质粒上的关键因子f.尽量双酶切（避免自我成环和反向连接）(双方都有)。g.避免无效切割（切割点内含另一种酶的切割点）h.双酶切点间尽量靠近，不丢失重要序列i.农杆菌转化法中，酶切点应该位于T-DNA内部EcoRI和HindIIIEcoRI和BamHI?避免无效切割[特别提醒]②目的基因要插入在启动子与终止子之间③插入的目的基因方向要正确，上游是启动子，下游是终止子（我们一般采取双酶切，防止目的基因与质粒反向连接（保证正确连接），并且防止目的基因与质粒各自独立连接成环。）④因为细胞内一般是进行选择性表达，我们选择使用受体细胞自身表达的基因的启动子或诱导性启动子才能比较有利于基因的表达（如要让其在牛乳中得到产物，就要选择牛乳腺细胞中分泌蛋白基因的启动子）⑤基因表达载体不仅仅是运载体，运载体的作用主要是转运并使目的基因同步复制，遗传给后代（属于基因克隆载体）。

而基因表达载体则是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并传递给子代，同时能够得到表达。3将目的基因导入受体细胞问题三

？目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞中维持稳定和表达的过程将目的基因导入受体细胞的方法各异有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。1.转化2.常用受体细胞将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创常用法：常用菌：大肠杆菌早期基因工程常用微生物作受体细胞过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体溶于缓冲液与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA一定温度Ca2+处理法（感受态法）3.导入方法(1)将目的基因导入微生物细胞这是因为微生物具有（P101）生理结构和遗传物质简单、生长繁殖快、代谢旺盛、对环境因素敏感、容易进行遗传物质操作等优点注意：原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。3.导入方法(2)将目的基因导入植物细胞花粉管通道法子房花粉柱头花粉管精子卵细胞胚囊多种操作方式微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注人子房中；受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊3.导入方法(2)将目的基因导入植物细胞花粉管通道法①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。3.导入方法(2)将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法原理①土壤农杆菌主要能侵染双子叶植物和裸子植物②Ti质粒含T-DNA（可转移DNA）片段，该片段能转移，并整合到被侵染细胞的染色体DNA上趋化性酚类物质3.导入方法(2)将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法Ca2+处理第一次导入第二次导入第一次拼接第二次拼接T-DNA整合并不是整个Ti质粒整合？[注意]①目的基因必须插入到T-DNA片段上（借助农杆菌的侵染和其T-DNA的特性，植物细胞才是受体细胞）②之所以农杆菌感染双子叶植物而不感染单子叶植物，是因为双子叶植物伤口组织分泌酚类物质，吸引土壤农杆菌③T-DNA这类DIAN片段被称之为转座子，可单独复制或撕裂下来，插入另一位点【思考】能否经过处理将该法用于单子叶植物?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为酚类，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性），使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。方法：显微注射法一般用受精卵做受体细胞结合胚胎工程得到转基因动物3.导入方法(3)将目的基因导入动物细胞为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？①体积大，易操作。②易表现出全能性。该步骤存在碱基互补配对过程吗？其他步骤呢？该步骤后往往经过一定的选择培养筛选，选择出成功导入重组质粒的受体细胞（依据标记基因的特性。采用不同方法）[特别提醒]如果利用T-DNA转移的目的基因，需要用到T-DNA片段上的标记基因筛选，不是质粒上的标记基因都可以筛选，但质粒上的其它标记基因还是表达的（都有独立的启动子，Ti质粒都进入了受体细胞，只是T-DNA片段整合））筛选出具备了标记基因的性状受体细胞，就说明目的基因成功导入或改造完生物了吗？问题四？4目的基因的检测与鉴定1.目的基因的检测与鉴定检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞或DNA分子杂交②表达检测转录检测——翻译检测——分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定或分子杂交抗原-抗体杂交PCR检测是否稳定维持和表达其遗传特性PCR检测检测目的基因是否导入如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因——通过PCR等技术检测转基因生物提取DNAPCR操作是否扩增出目的基因M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；

PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果电泳操作1.分子水平的检测检测目的基因是否转录如：检测Bt基因是否翻译出mRNA——通过PCR等技术检测提取棉花细胞mRNA逆转录产生DNA对扩增产物进行检测用与Bt基因相关的引物进行PCR扩增BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录1.分子水平的检测检测目的基因的量，或mRNA的量——荧光定量PCR如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白苏云金芽孢杆菌提取Bt毒蛋白注射小鼠体内抗体标记抗体提取蛋白电泳分离抗原抗体杂交检测目的基因是否翻译——通过抗原-抗体杂交检测1.分子水平的检测转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗除草剂植物获取目的基因产物的转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡病毒（菌）接种实验未染病盐水浇灌正常生长喷洒除草剂正常生长提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常抗性鉴定、活性鉴定等2.个体水平检测：[视野拓展]DNA分子杂交技术根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。[视野拓展]DNA分子杂交技术DNA附着在膜上变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abd报告基因（含荧光素分子）硝化纤维素c加探针抗原抗体杂交带多种抗虫基因套种普通棉跟踪监测改进并不严重1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。整合了多个拷贝的基因，从而导致目的基因失活。外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。练习与应用（P83）二、拓展应用2.八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。练习与应用（P83）二、拓展应用（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______

，标记基因是_____

，质粒pSYN12424的作用是______

。ctrⅠ基因和psy基因pmi基因将目的基因送入水稻细胞（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？不能。限制酶可能将它切断。(3)请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广'黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。练习与应用（P83）二、拓展应用维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米'”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开问题五？5探究·实践DNA片段的扩增及电泳鉴定1.原理(1)扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理（操作中DNA变性原理，不是PCR技术的原理），通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。

一次PCR一般要经历30次循环.DNA半保留复制2.思路(2)鉴定：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳(在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关)(1)用微量移液器按照配比要求在微量离心管中依次加入各组分。(2)盖严离心管的盖子，离心约10s，使反应液集中在管的底部。(3)设置好PCR仪的循环程序，进行反应。3.步骤[特别提醒]无菌操作，防止外源DNA污染——灭菌、作阴性对照（不加模板）保证都能充分完成复制有什么特殊的地方？小份低温保存每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换①根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。②将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。③待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内(4)鉴定：2.步骤(4)鉴定：2.步骤④将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1__mm为宜。⑤将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。⑥电泳（根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm）⑦待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。⑧取出凝胶置于紫外灯下观察和照相横向水平电泳操作示意图(4)鉴定：2.步骤PCR中也会出现多条带，为什么？缺点：只能作定性分析，不能准确定量。

易造成污染出现假阳性，使其应用受到限制【结果分析】一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析:模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。(1)未出现扩增条带可能的原因有:模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂(如蛋白酶K、苯酚、EDTA);TaqDNA聚合酶失活;引物出现质量问题;引物浓度不合适;Mg浓度过低;变性温度过低;变性时间过短;目的序列改变;等等。(2)出现非特异性扩增条带可能的原因有:模板DNA出现污染;TaqDNA聚合酶出现质量问题;引物特异性不强(如与非目的序列有同源性)或形成引物二聚体;Mg浓度过高;退火温度(复性时的温度)过低;PCR循环次数过多;等等。(3)本实验应设置对照组。阳性对照用于检测PCR的效率，阴性对照用于检测是否存在含有目的序列的DNA的污染。【结果分析】阳性对照:所谓的阳性对照是指采用已知的必定可以得到扩增产物样品。作用是判断仪器、试剂、操作是否存在问题，