花椒组织培养快繁技术规程编制说明

属落叶小乔木，是我国广泛栽培的重要木本油料和香料经济树种，也是国家重点发展的优势特色经济林和天然植物香料树种之一，兼具经济、药用及生态价值，开发前景广阔。近几年随着花椒市场发展以及乡村振兴政策的扶持，河南省西部丘陵山区及沿黄河周边市县利用自身有利地形和气候条件，大力发展花椒产业，逐渐形成了具有一定规模的产业集群,已成为许多地区的特色农产品支柱产业。2020年底河南省林业科学研究院花椒课题组对河南省12个地市花椒种植情况进行了调查统计，得出：河南省花椒主产区总种植面积为69461.47hm2，其中花椒种植面积最大的三门峡，达到了34097.04hm2;其次为洛阳16847.51hm2。随着河南省花椒主产区种植面积的扩大，河南花椒产业逐渐暴露出一些问题。一是很多种植户在花椒种植品种、种植技术和管理水平等方面掌握不到位，出产的花椒品质不一；二是最近几年花椒行情持续下行，大部分种植基地亏损严重；三是受大林业环境影响，花椒种植产业面临着管理投入不够、管理粗放等问题，造成花椒产量和品质持续下降，抗风险能力进一步降低。河南林业拥有较为丰富的资源和广阔的发展空间。为了提升林业品种的质量和效益，推动林业产业的转型升级，河南省政府及相关部门制定了一系列品种培育政策。设立了林业发展专项资金，用于支持林业品种的选育、推广和示范等工作，对于符合条件的林业品种培育项目，给予一定的财政补贴和奖励；对从事林业品种培育的企业和个人，给予一定的税收减免和优惠，鼓励企业加大研发投入，提高品种培育的技术水平和创新能力；设立林业品种审定委员会，对申报的新品种进行严格的审定和评估；加强林业品种的知识产权保护，打击侵权行为，维护育种者的合法权益。这些政策的主要目标是加强林业品种的创新与研发，提高品种的适应性和抗逆性，促进林业产业的可持续发展。花椒种植急需紧跟河南林业产业发展的步伐，才能克服目前产业面临的诸多问题。目前河南花椒省审良俱佳，但是皆无大量苗木繁育，因此未得到广泛推广应用。花椒育苗目前主要以种子苗为主，种子育苗过程中，由于遗传和环境因素的影响，可能导致苗木的变异性较大，增加了选育优良品种的难度。利用组织培养技术繁殖花椒，繁殖速度快，系数大。通过组织培养获得的植株，能够保持品种的优良性状，能够确保后代遗传特性与母本一致。对于因长期无性繁殖而退化的品种，组织培养技术还有助于恢复其原有品质。制定花椒组织培养快繁技术规程，对于利用组织培养技术提高花椒繁殖效率、保持品种优良性状、解决传统育种方法的不足、促进花椒产业的发展等方面都具有重要的意义。河南省颁布过的植物组织培养技术规程较少，曾颁布过关于太行菊、蝴蝶兰、泡桐和金银花四种植物的组织培养技术规程，目前现行的只有蝴蝶兰、金银花组织培养技术规程。河南省的一些科研机构和企业也在植物组织培养技术方面进行了深入的研发和应用。随着生命科学的不断发展和河南省农业现代化的不断推进，植物组织培养技术在河南省的应用前景将更加为推广和指导花椒组织培养快繁技术，课题组将花椒组织培养技术进行规范总结，特提出建立花椒组织培养快繁技术规程，以期对从事花椒组织培养研究、生物育种研究的从业人员河南省地方标准《花椒组织培养快繁技术规程》由河南省林业局提出并归口，由河南省林业科学研究院具体起草。2024年第二批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫市监函〔2024〕88号文），正式批准该技术规程的起草（立项编号：20242110160）。（二）编制原则和依据《花椒组织培养快繁技术规程》的编制基于团队科学试验和生产实践数据的积累，确保了组培技术的可靠性和有效性。通过科学的试验和验证，确定了最适的培养基配方、激素浓度、培养条件等，确保了花椒组织培养快繁技术的成功率和效本标准的编制注重实用性和可操作性，便于生产者和技术人员理解和应用。标准详细描述了花椒组织培养快繁技术的各个环节和步骤，包括范围、规范性引用文件、术语和定义、缩略语、培养容器与接种器械的灭菌、培养基的配制与灭菌、外植体的处理、芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗与移栽等技术以及培养所需WPM培养基成分、炼苗所需MS营养液成分等，以便生产者在实践中进行参考和调整，具很强的可操作性和指导性，对实现花椒产业的规范及标准化发展，提供了重要的技本标准的制订主要依据国家有关法律、法规，河南省地方标准管理办法和本项标准研究的实际经验。标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，注重标准的可操作性，严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则准化文件的结构和起草规则》进行编写。《花椒组织培养快繁技术规程》的编制原则和依据是多方面的，包括科学性、实用性、技术内容的全面性和系统性，以及国家法律法规和标准、科学研究成果、实践经验等。这些原则和依据共同构成了规程编制的基础和支撑，确保了技术的规小组，查阅相关国家标准、行业标准、省内外同类标准，广泛收集相关技术资料，整理课题组研究的相关材料，并结合实际生产需要，这些准备工作为科学制定本标准奠定了良好基础。本标准主要起草小组成员为王文君、翟晓巧、任媛媛、王念、侯志华、何威、董玉山、王星斗。2023年11月依据河南省市场监督管理局下发的《2024年河南省地方标准立项指南》，课题组梳理前期工作思路，整理汇总材料，形成标准草案，并向河南省市场监督管理局提交立立项后，起草小组确定了详细实施方案，并进行了任务分工，明确小组成员的责任和完成任务的时间。按照时间进度要求，起草完成《花椒组织培养快繁技术规程（工作组讨论标准编制小组结合已有的技术资料以及验证性研究的结果，经过反复研讨，并认真学习了标准制定的一系列文件，对标准制定的格式、内容、术语表达方式等进行了更深入的理化文件的结构和起草规则》的要求和格式，结合生产实践、调查分析、试验总结、调研咨询，在标准工作组讨论稿的基础上，经过反复研讨，于2024年12月形成了《花椒组织培养快繁技术规程（征求意见稿）》及《花椒组织培养快繁技术规程当前，花椒属植物常用的组织培养方法主要包括愈伤组织培养、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养、生根培养这四个培养过程，培养过程繁琐，且外植体通常为花椒嫩叶或带芽茎段，外植体选择性单一，生产效率不高。许旭（2014）使用带芽茎段为外植体材料，经过了愈伤组织诱导培养、增殖培养以及生根培养等步骤，进行大红袍花椒组织培养，但其诱导率、生根率以及增值系数分别为72.8%、66.7%以及4.6，效果并不理想，且过程较繁琐。秦素洁等（2018）采外植体材料，整个组织培养过程只有两种培养基，但增值系数和生根率分别为5.42以及83%，效果也不甚理想并不存在针对花椒流程简单且组培效果好的技术方案。标准起草小组长期以花椒为研究对象，主要开展花椒优异新种质资源挖掘、花椒良种选育及高效栽培技术等方面的科学研究。针对上述问题，起草小组对花椒组织培养技术进行优化，简化培养流程进行了深入探索通过改进培养基配方和培养条件，成功提高了诱导率和生根率，形成了高效、简洁的快繁技术体系，显著提升了花椒生产效率。在优化后的体系中，愈伤组织诱导率提升至85%，生根率高达90%。在培养过程中，以花椒带芽茎段、叶柄作为外植体，经过大量的实验和研究，最终确定了以花椒叶柄作为外植体材料，这不仅拓宽了外植体的选择范围，而且相较于传统的带芽茎段，叶柄具有更高的细胞同时，起草小组通过试验不同的培养基配方和生长调节剂组合，优化了培养基的配方，构建了针对花椒组培的芽诱导培养基和生根培养基，将现有技术中愈伤组织培养、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养过程融合成一个培养过程，减少了不必要的培养步骤，使得整个组织培养流程更为简洁高效。同时，通过对培养条件的精细调控，显著提高了花椒组培的诱导率和生根率，降低了培养成本，为花椒的快繁技术提供了新的解决通过对前期的花椒组织培养技术数据总结和梳理，起草小组于2023年申请发明专利《一种花椒组织培养基及其应用》，现处于实质审查阶段。采用该发明培养基和组培方法对花椒叶柄进行组织培养，不定芽诱导率93.33%，增殖系数7.4，生根率90%，效率极高。相比于传统由愈伤组织培养基、不定芽诱导培养基、不定芽增殖培养基以及生根培养基组成的花椒组培培养基，该发明培养基仅包括芽诱导培养基和生根培养基，有效简化了培养过程，且该发明培养基相较于传统培养基促诱导、起草小组还对炼苗与移栽环节进行深入了研究，总结出了切实可行的方法，确保了组培苗的顺利成活与生长，为花椒的快速繁殖与大面积推广提供技术支持。在确定《花椒组织培养快繁技术规程》的主要内容时，起草小组充分考虑了花椒组织培养快繁技术的关键步骤和要点，确保了本标准的全面性和实用性。花椒组织培养快繁技术的成功，很大程度上依赖于外植体的正确选择。在选择外植体时，我们优先考虑了花椒的遗传稳定性、生长状况以及无菌处理的可能性。通过多次试验和对比不同外植体（如花椒茎段、叶柄）的诱导效果，最终确定了以花椒叶柄作为外植体的最佳选择（参照表1）。研究结果显示，花椒叶柄因不宜褐化、细胞活跃度高、生长速度快，成为诱导效果最佳的外植体类型。在相同的培养条件下，花椒叶柄的诱导率显著高于带芽茎段，同时生根率也表现出明显的优势。此外，花椒叶柄的无菌处理相对容易，减少了因污染导致的培养失败率，进一步提升了整体培养效率。为了确保外植体的质量，我们还制定了严格的外植体采集、处理和保存标准操作流程，从源头上保障了花椒组织培养快繁技术的稳定性和可%WPM+0.5mg/L6-WPM+0.5mg/L6-ZWPM+0.5mg/L6-WPM+0.5mg/L6-Z注：WPM为WPM基本培养基（WoodyPlantMedium，6-BA为六苄氨基腺嘌呤（6-），），本标准采用叶柄作为外植体进行芽的诱导。芽的诱导过程中主要是激素浓度的确定。首先，将叶柄放置于附加不同浓度）（），mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.002、3）1-2345-7681-增殖培养是花椒组织培养快繁技术中的重要环节。通过调整培养基中的激素浓度配比，可以显著影响花椒外植体的增殖效果。在实验中，我们采用了不同浓度的6-BA、NAA和TDZ进行配比，以观察其对花椒外植体诱导率和增殖系数的影响。从实验结果来看，不同的激素浓度配比对外植体的增殖效果有着明显的差异。例如，当6-BA浓度为0.5mg/L、NAA浓度为0.2mg/L、TDZ浓度为0.003mg/L时，诱导率达到了最高的93.33%，且增殖系数也相对较高，为7.4。这说明该配比对于花椒外植体的增殖培养具有较好的效果，该配比和芽诱导的最优此外，我们还发现，在相同6-BA和NAA浓度下，随着TDZ浓度的增加，诱导率和增殖系数呈现出先增加后减少的趋势。这提示我们在进行增殖培养时，需要选择合适的激素浓度配诱导的丛生芽生长健壮，颜色鲜绿，为后续生根培养奠定了良好的基础。在增殖培养过程中，我们还发现适当的光照和温度条件对丛生芽的生长和增值效果有显著影响。通过优化这些培养条件，我们可以进一步提高花椒组织培养的快繁效率。生根培养阶段的主要目标是促进丛生芽生根，形成完整植度的筛选。将诱导出的芽将其转移到附加不同浓度IBA(0~根长和根数挑选出根诱导的最适培养基。根据表3中的实验数的组合下，生根率达到最高，为80.16%，且30天根长为5.5cm，根数适中，因此该配比为根诱导的最适培养基。（生根情况参见图4、5）在确定了最适培养基后，进一步进行了生根培养的稳定性和重复性验证。通过多次试验，确认了该培养基条件下花椒芽的生根率稳定，且根系生长健壮。此外，还观察了不同光照、温度和湿度条件下，对生根培养的影响，以优化培养条件，提1-2-3-4-51-6-7-8-1911在炼苗与移栽部分，标准详细阐述了炼苗的方法、移栽的时间选择、以及移栽后的管理措施，确保花椒幼苗能够顺利适炼苗过程主要包括逐步降低培养室内的湿度和温度，增加光照时间和强度，使幼苗逐渐适应自然环境。移栽时间通常选择在幼苗根系发达、叶片茂盛、生长健壮的时期进行，以确保幼苗具有较强的生命力。移栽后，还需进行定期浇水、施肥、除草和病虫害防治等管理措施，为花椒幼苗的生长提供良好的环境条件。通过这些细致的炼苗与移栽步骤，可以显著提高花椒幼苗的移栽成活率，为花椒的快速繁殖和规模化种植奠定坚本标准未采用相关的国际标准和国外标准。本标准在编写过程中没有重大意见分歧。本标准符合《中华人民共和国标准化法》、《中华人民共和国标准化法实施条例》、《国家标准管理办法》、《林业标准化管理办法》等国家有关法律法规的规定。本标准各项指标的确定是在国家和行业相关标准的基础上，结合标准起草单位前期研究工作和生产实践提出的，具有严密的科学性和较强的可操作性，适用于河南省花椒组织培养快速繁殖和产业化育苗，对花椒产业的可持续发展有重要意义，建议将本标准作为推荐性地方标准发布实施。为确保标准通过举办培训班、现场示范、技术讲座等方式，组织相关技术人员和花椒种植户进行技术培训，进行专业培训，使他们充分了解并掌握花椒组织培养快繁技术的操