（高清版）DB12∕T 653-2016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法　　

B45DB12QuantitativePCRmethod天津市市场和质量监督管理委员会发布本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR法下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版GB/T6682分析实验室用水规格和实时荧光PCRrealtimePCR每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的猪源性成分porcine-derive鸡源性成分chicken-derive算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。Rd1Rd1-P：5′-FAM-CGGCACSus-ACTBSus-P：5′-FAM-TCTGDucg作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/mL混匀，55℃水浴消化数小时，期间不停颠倒混匀，直至缓慢颠倒混匀，12000rpm离心10min，转移上清至一5.3.4.1标准样品和试样实时荧光P进行45次循环扩增反应（95℃变性15s，60℃退火延伸1min在第二阶段的退火延伸（60℃)时段收集荧光信号。4—2.0µL2.0µL—25.0µL—1.0µL1.0µL0.5µL1.0µL—25.0µL情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性标准曲线公式：式中：y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；x—模板靶标浓度以10为底数的对数；b—标准曲线的截距。5.3.5.4数据可接受的标准动物源性成分种属特异性基因阴性对照和空白对照的Ct值≥38;16SrDNA阴性对照和空白对照的16SrDNA内标基因Ct值≥38;标准曲线的R²≥0.98,标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1,满足上述条件，可以进行结果计算。否则重新进行实时荧光PCR扩增。5.3.5.5含量计算5.3.5.5.1计算试样模板靶标浓度将试样的动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的Ct值分别带入动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的标准曲线方程，计算动物源性成分种属特异性基因和16SrDNA内参基因的靶标浓度。计算试样模板靶标浓度公式：式中：n—模板靶标浓度y—测试样品的Ct值；a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.5.5.2计算试样中动物源性成分种属特异性基因含量将动物源性成分种属特异性基因的靶标浓度和16SrDNA内参基因的靶标浓度带入公式(3),计算出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。计算试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量的公式：式中：c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百分含量(%);Du一动物源性成分种属特异性基因靶标浓度；6结果分析与表述6.116SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因均出现典型扩增曲线，且16SrDNA内参基因和动物源性种属特异性基因的Ct值<36,表明样品中检出某动物源性成分。表述为“样品中检测出某动物源性成分，某动物源性成分含量为c”。依照6.1-6.2进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGA61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGGAGACTGGCGGGGAAGGAAGAGACTGGCGGGGAAGGAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCT注：划线部分为OA-F和OA-R引物序列，方61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTGCACTCTCTGCATATATCCACGGTT