液相色谱分析仪法

关于液相色谱分析仪法2025/3/21第1页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21一、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。第2页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21液相色谱仪（1）

highperformanceliquidchromatograph

第3页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21液相色谱仪（2）第4页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21液相色谱仪（3）第5页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21液相色谱仪（4）第6页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21二.概论：

㈠定义：以液体为流动相的色谱法称为液相色法。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周长。高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：第7页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/211.应用了颗粒极细（一般为10μm以下）规则均匀的固定相，柱效高，分离效率高；2.采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；3.广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。目前，已发展了多种固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。第8页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21㈡.色谱法分类

按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC):适用于分离挥发性化合物。有机物质中分子量小于400的采用气相色谱法分析，此范围的物质约占有机物质总数15%~20%.液相色谱法(LC):适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。分子量为400~2000的有机物质可采用液相色谱法分析，而分子量大于2000的则须用凝胶色谱法。第9页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21按固定相性质及外形分类柱色谱:固定相装在柱管内的色谱分析法纸色谱:固定相为滤纸的色谱分析法薄层色谱:固定相压成或涂成薄膜的色谱分析法第10页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21（三）HPLC的主要分离类型和原理：

高效液相色谱法按分离机理的不同主要分为四类：1.

液-固吸附色谱（liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固体吸附剂。如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：主要是非极性的烃类（如己烷、庚烷）并加入少量极性溶剂作缓和剂（如水、甲醇）。基本原理：组分在固定相吸附剂表面对不同物质吸附能力不同使混合物分离的；吸附力越强,保留时间越长,反之,保留时间短,。适用于分离分子质量中等（200~1000）的油溶性试样或极性较小的植物色素等组分，大多数用于非离子型化合物，。常用于分离同分异构体不适宜于分离强极性的离子型化和物和同系物。

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾（离子型化合物易产生拖尾）；第11页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/212.液-液分配色谱

（liquid-liquidpartition

chromatography）

固定相与流动相均为液体，流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

K=式中，Cs—溶质在固定相中浓度；Cm--溶质在流动相中的浓度；分离的顺序取决于K值，在同一色谱条件下，样品中K值大的组分保留值大；后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

第12页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。固定相：将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC);

流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反。第13页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21正相色谱法：由极性固定相(如氨基与腈基键合相)和非极性（或弱极性）流动相(烷烃类如正已烷、环已烷）所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱、氨基柱等，代表性的流动相是正己烷。用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。吸附色谱也属于正相色谱反相色谱法；由非极性固定相和极性流动相所组成的HPLC体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶(ODS柱、C18、C8），代表性的流动相是甲醇-水和乙腈-水或水的缓冲液。是当今液相色谱的最主要分离模式。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。

第14页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，后来在此基础上发展了一种新型固定相---化学键合固定相。化学键合固定相：通过化学反应将固定液（各种不同基团）键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。在HPLC整个应用中占80%以上。键合固定相的载体主要是硅胶，根据在硅胶表面（具有--≡Si--OH基团）化学反应不同可制成四种键合相：（1）硅氧碳型（≡Si—O—C=，硅胶与醇类发生酯化反应）。（2）硅碳型（≡Si—C=，硅胶与卤代烷反应）。（3）硅氮型（≡Si—N=，硅胶与胺类反应）。（4）硅氧烷型（≡Si

—O—Si—C=，硅胶与有机硅烷反应）。稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广第15页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21化学键合色谱与液液分配色谱一样，也可分为正相和反相色谱。反相键合色谱采用非极性固定相，键合的基团有C2、C4、C6、C8、C18、C22烷基和苯基。其中最常用的是C18，又称ODS一十八烷基硅烷键合相。所用的流动相为极性溶剂，以水为底溶剂,再加入有机溶剂,最常用的是甲醇-水、乙腈-水和四腈呋喃-水。正相键合色谱采用极性固定相，如氨基、腈基等极性基团；非极性或弱极性流动相，一般为烃类溶剂，如己烷、庚烷等。第16页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（4）有利于梯度洗脱；化学键合固定相的特点第17页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序

极性小的先洗出极性大的先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）第18页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/213.离子交换色谱

（ion-exchange

chromatography）固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：碱金属、碱土金属等离子混合物的分离；食品中添加剂和污染物的分离；生物大分子如氨基酸、核酸等。第19页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/214.体积排阻色谱

（size-exclusionchromatography）

凝胶(具有一定大小孔隙分布)

固定相：化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料,是有一定孔径的多孔性填料。流动相：在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。

第20页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21基本原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。常用的流动相为水、四腈呋喃等可对相对分子质量在2000以上范围内的化合物按质量分离,如多肽、蛋白质、核酸等。第21页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21分离类型选择

choiceofseparationtypes第22页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21基本概念和术语：

色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见

色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。

基线(baseline)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。第23页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21

噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

拖尾因子(tailingfactor，T)—T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。第24页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21

保留时间(retentiontime，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

分配系数(distributioncoefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。

K＝

式中Cs、Cm分别是组分在固定相和流动相中溶质的浓度。第25页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数；离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)；凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

理论塔板数(theoreticalplatenumberN)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。第26页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21三.高效液相色谱法的特点

featureofHPLC

特点：高压、高效、高速高灵敏度流动相选择范围广。是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。第27页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21高压——压力可达150~420Kg/cm2。色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速——流速为0.1~10.0ml/min。高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。流动相选择范围广-------大部分的有机溶剂以及水和有机溶剂的混合物均可用。第28页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21四.HPLC的系统组成和工作原理：（一）系统组成：高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统五大部分组成。

1.高压输液系统：由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。

2.进样系统：包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。

3.分离系统：包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。

4.检测系统：检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。

5.记录系统；纪录仪、积分仪、色谱工作站第29页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21（二）工作原理储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,

在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,

被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。第30页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21五.流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.工作流程：高压泵将样品由流动相带入色谱柱分离后，经检测器将光信号转变为电信号并放大，最后以图谱的形式显示在工作站荧屏上。第31页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/212.主要部件(1)高压输液泵：有恒流泵和恒压泵两种。主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），当液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）第32页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21泵的使用和维护注意事项

①防止任何固体微粒进入泵体

:过滤流动相②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内过夜或更长时间。否则由于溶液的静置，可能析出盐的微细晶体，损坏密封环和柱塞等③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。⑤流动相必须先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性第33页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21(2)梯度淋洗装置梯度洗脱就是在分离过程中使用两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度）。一类是内梯度装置（又称高压梯度）。相当于气相色谱中的程序升温。第34页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21内梯度（高压）:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外梯度（低压）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。第35页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21梯度洗脱装置是通过两个输液泵流速的变化，改变流动相的洗脱能力，其作用与气相色谱的程序升温类似。ABABCC第36页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21(3)进样装置流路中为高压力工作状态。包括进样口、注射器和进样阀等，其作用是将试样有效地送入色谱柱上进行分离。通常使用耐高压的六通阀进样装置和自动进样器，其结构如图所示：

第37页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。

第38页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21(4)高效分离柱色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。

1.构造：色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱体为直型不锈钢管，内径1~6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

2.分类：色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类

①常规分析柱（常量柱），内径常用4.6mm，柱长15或25cm；②毛细管柱（又称微柱，内径0.2~0.5mm；③实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm第39页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21柱的使用和维护注意事项

1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械动

2.应逐渐改变溶剂的组成，3.色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲，除去留在柱头的杂质。4.选择适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落

5.避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内

6.经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质

7.保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料如C18柱，只能在pH2~9范围内使用。第40页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21(5)液相色谱检测器它是色谱仪的的“眼睛”，是测量色谱柱流出组分浓度变化的装置。分为两类；1.通用型检测器，它是连续测定柱后流出液（流动相加溶质）总的物理性质的变化，如示差折光检测器和电导检测器；近年来出现了新兴的通用型检测器----蒸发散射光检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。2.选择性检测器（溶质性检测器），它是测定流出液中溶质（待测组分）的物理性质的变化，对流动相无信号，如紫外检测器和荧光检测器。目前最常用的主要有紫外--可见光光度检测器，荧光光度检测器和示差折光检测器。第41页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21检测器的性能指标:1）噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。

2）灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。3）检测限(detectionlimit)

：指恰好产生可辨别的信号（通常用2倍或3倍噪音表示）时进入检测器的某组分的量。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好4）线性范围(linearrange)：指检测器的响应信号与组分量成直线关系的范围，即在固定灵敏度下，最大与最小进样量（浓度型检测器为组分在流动相中的浓度）之比。。5）池体积：除制备色谱外，大多数HPLC检测器的池体积都小于10µl。

第42页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21a.紫外-可见光检测器是应用最广的一种选择性检测器，对大部分有机化合物有响应。作用原理：是待测组分对特定波长的紫外或可见光有选择性吸收，适合于紫外或可见光区有吸收的物质的测定。检测器输出信号的大小即吸光度与待测组分的浓度之间服从郎伯-比尔定律。按波长可分为固定波长和可变波长两类。固定波长中用的最多的是UV-254，其次是UV-280，采用低压汞灯为光源，可检测许多有机化合物。可变波长检测器多采用氘灯或钨灯为光源，提供200~800nm范围内连续可调的紫外、可见光，可按样品的吸收特征任意选择工作波长。其灵敏度小于固定波长检测器第43页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21

紫外检测器的特点：

①灵敏度高（10-9g)；②线性范围宽(105)；③流通池很小（1mm×10mm容积5--8μL）④对流动相的流速和温度变化不敏感；⑤波长可选，易于操作；⑥可用于梯度洗脱。

第44页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第45页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21第46页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21光电二极管阵列检测器第47页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21c.示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；第48页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21示差折光检测器第49页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21d.荧光检测器（fluorescencedetector）高灵敏度(10-11g)、高选择性；线性范围不如UV检测器，仅为103。适合于有л-л共轭体系的大分子结构复杂并能产生强荧光的化合物。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。其结构和原理与一般的荧光光度仪基本相似，不同处在于其样品池是一种体积极小和无液体扰动的在线样品池。第50页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21六.固定相和流动相㈠固定相：固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。⒈

表面多孔型固定相(薄壳型填料)

它的基体是实心玻璃球，在球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、氧化铝等。这类固定相出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。第51页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21⒉全多孔型固定相

由直径为3~10nm的全孔硅胶、氧化铝、硅藻土微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5~10um），传质速率快，特点是柱效高，分离能力强，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。

⒊化学键和相固定相它是近几年发展起来的一种新型固定相，是用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到载体表面。如烷基（C18、C8）、氨基、氰基等。第52页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21㈡流动相

由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。⒈对流动相溶剂的基本要求是：（1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂与检测器匹配。（3）高纯度:有机溶剂一般为色谱纯试剂，水为高纯水。（4）化学稳定性好（5）低粘度溶剂，如甲醇、乙腈等。（6）配好的流动相必须超滤（0.45um）

（7）使用前还需脱气（真空、通N2、超声波）

第53页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/212.流动相类别按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水。若采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第54页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/213.流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)第55页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21七.最常用的色谱定性定量分析方法

㈠

定性分析在色谱分析中最常用的简便可靠的定性方法是用已知物（标准样）定性法（即保留时间定性法）。这个方法的依据是：在一定的固定相和一定的操作条件下（如柱长、柱填料、流速），任何物质都有确定的保留值（保留时间）。测定时只要在相同的操作条件下，分别进样，测定已知物和未知组分的保留值。如果保留值相同，可认为是同一化合物。

第56页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21㈡

定量方法：

⒈归一化法：指将所有出峰组分的含量之和按100%计算的定量方法。如果样品中所有组分都能流出并有响应信号可用此法。

归一化法的优点:简便、准确，不必准确称量和进样操作条件对结果影响较小。此法不适用于痕量分析。第57页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/212.内标法：⑴内标物要满足以下要求：a.试样中不含有该物质；b.与被测组分性质比较接近；c.不与试样发生化学反应；d.出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。第58页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/21⑵内标法特点(a)内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。(b)每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。第59页，共66页，星期日，2025年，2月5日2025/3/213.外标法：以与待测组分同质的物质作为参比物（标准物），根据样品量和标准物的量，以及待测组分和标准物的响应信号进行定量的方法。外标法又称标准曲线法和单点校正法等。⑴