关于高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中β-激动剂类药物残留的研究

1实验部分1.1实验材料与设备1.1.1实验材料牛肉：经检验β-受体激动剂呈现阴性的牛肉，绞碎均质。1.1.2主要试剂甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氢氧化钠溶液、乙酸铵缓冲液、甲酸水溶液-甲醇溶液（体积比=90∶10）、β-葡萄糖醛酸酶（30U·mL-1）。对照品：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇（含量均≥98%）。同位素内标：莱克多巴胺-d3、克伦特罗-d9、沙丁胺醇-d3。1.1.3主要仪器设备TSQQuantis型号高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）；分析天平；氮吹仪；水平振荡器；固相萃取装置等[1]。1.2混合对照品溶液及内标液的制备准确称取莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇各10mg,放置于100mL的棕色量瓶内，用甲醇定容，将其制备为0.1mg·mL-1的混合对照品溶液，4℃避光保存备用，临用时可用甲醇稀释为所需浓度混合液。称取3种同位素内标10mg，同样的方法配置为100μg·mL-1的储备液保存，用时可用甲酸水溶液稀释为100μg·L-1的混合液，获得内标工作液[2]。1.3样品前处理1.3.1酶解和提取称取新鲜或者冷藏解冻的试料2g置于50mL离心管内，加入0.2mol·L-1的乙酸铵缓冲液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μl，涡旋均匀，于避光条件下37℃水浴振荡16h，放至室温备用。1.3.2萃取、净化、浓缩取上步骤获得备用液，加入100ng·mL-1的内标液100μL,涡旋均匀并在8000r·min-1的条件下离心8min，取上清液，加入5mL高氯酸溶液（0.1mol·L-1）,涡旋均匀，用高氯酸调节pH至1，在8000r·min-1的条件下离心8min，在获得的上清液中加入NaOH溶液（10mol·L-1）,调节pH至10。加入乙酸乙酯15mL，中速振荡5min，在5000r·min-1的条件下离心5min，获取上层有机相。对于上层水相，可加入叔丁基甲醚10mL进行提取，将前后2次提取的有机相进行合并，50℃氮吹，并用甲酸溶液（2%）溶解备用[3]。应用混合型阳离子交换固相萃取柱进行净化，分别用3mL甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，备用液过柱后用2%甲酸与甲醇各3mL淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3mL洗脱后50℃氮吹。用0.5mL甲醇-1%甲酸溶液溶解残余物后过滤膜（0.22μm孔径），获得供试品溶液。1.4仪器条件色谱柱：WatersC18(XbridgeBEH2.5μm)；柱温：40℃；进样量：20μL；流速：0.2mL·min-1；流动相：溶剂A+溶剂B。梯度洗脱程序见表1。表1流动相及梯度洗脱程序表离子源：电喷雾（ESI+）；扫描方式：选择反应检测扫描（SRM）；离子喷雾电压：3500V；离子传输管温度：320℃；蒸汽温度：350℃；鞘气流速：40Arb；辅助气流速：5Arb。2结果与分析2.1酶解温度的优化通过查阅相关文献得知，β-葡萄糖醛酸酶适用的温度处于40～110℃，于试料牛肉离心管内，加入0.2mol·L-1的乙酸铵缓冲液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μL,涡旋均匀后分别于避光条件下37、45、53、61、69℃水浴振荡16h，再经萃取、净化、浓缩后对3种β-受体激动剂含量进行检测，结果见表2。表2不同酶解温度对β-受体激动剂测定结果的影响表表2显示,当酶解温度在37～45℃范围内时，3种β-受体激动剂的测定结果差距不明显,均与推荐值最接近，随着温度的继续升高，在达到53℃后，测定值会有所降低，这可能因为温度过高会导致物质挥发丢失。所以，最合适的酶解温度为37℃[4-5]。2.2酶解时间的优化设置样品酶解与提取前处理的酶解时间为37℃下水浴振荡8、12、16、20、24h，再经萃取、净化、浓缩后对3种β-受体激动剂含量检测，结果见表3。表3不同酶解时间对β-受体激动剂测定结果的影响表表3显示，酶解时间为8、12、16h时，β-受体激动剂含量测定值差距相对较小，均接近推荐值5μg·kg-1，适合酶解时间为8h。2.3净化条件的优化应用SPE技术净化，分别创建4种淋洗液与洗脱程序，研究加标回收率，选择最佳净化条件，具体见表4。表4不同净化条件的β-激动剂回收率表表4显示，方法1与方法2下3种β-激动剂的平均回收率差异性不大，分别为98.5%、98.4%。因此，该实验净化条件可以选择方法1或者方法2。2.4方法回收率分析各称取牛肉样品2g，按照上述最佳前处理条件，分别添加不同梯度的3种β-受体激动剂标准物质0、5、5、10ng，并定容至1mL，计算其分析结果及回收率见表5。表53种β-受体激动剂加标回收实验结果表由表5可知，β-受体激动剂化合物的加标回收率处于84.6%～97.2%，代表该检测方法具备较高的准确度，可以满足检测要求。3结语本实验采用酶解与固相萃取的前处理技术和液质联用对牛肉中的3种β-受体激动剂进行检测，发现最佳的酶解温度为37℃，酶解时间为8h，净化条件如下。活化：3mL甲醇；3