超高效液相色谱-串联质谱法研究木瓜中熊果酸和齐墩果酸含量

酸木瓜[Pseudocydoniasinensis(Thouin)C.K.Schneid.]别名邹皮木瓜、木瓜海棠、木瓜等，是蔷薇科木瓜属灌木或小乔木[1]。酸木瓜中含较多果酸和单宁，吃起来酸、涩，解腻开胃，舒筋湿痹，在云南人的生活和菜品中多为常见。《诗经》记载：“投我以木瓜，报之以琼琚。”古人将酸木瓜视为和“琼琚”一般美好的事物。古籍中对酸木瓜的记载还有很多，关于木瓜泡酒早有记载。《齐民要术》记载，木瓜以苦酒鼓汁，密度之，可按酒食，密封藏百日，乃食之，甚益人。酸木瓜中的主要化学成分有熊果酸、齐墩果酸、苹果酸、绿原酸、芦丁、多糖、黄酮、鞣质等[2]。其中，熊果酸和齐墩果酸为五环三萜有机酸。据文献报道，齐墩果酸可消炎抑菌，降低转氨酶，促进肝细胞再生，防止肝硬化，强心、利尿、降血脂、降血糖，增强机体免疫力[3]。熊果酸是齐墩果酸的同分异构体，药理研究证明，熊果酸具有抗癌、促进免疫、稳定心血管、增强毛细血管弹性等作用。由于木瓜具有药用、食用、观赏等多种用途，越来越受人们的喜爱。基于此，本文采用有机溶剂超声提取，离心，旋转浓缩，C18柱净化，正己烷洗脱，氮吹，旨在探索酸木瓜中熊果酸和齐墩果酸的提取工艺。实验结果表明，这种方法快速，且样品损失较小，克服了传统方法的不足，具有高效、简便、快速、重复性好的优点，可以为木瓜的开发利用提供参考依据。1材料与方法1.1仪器、试剂、材料①仪器。岛津液相色谱仪LC-30A，与三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用系统；GH252双量程电子天平；超声提取仪；艾本德离心机；旋转蒸发仪；氮吹仪。②试剂。甲醇、正己烷、乙醇，均为色谱纯；C18固相萃取柱。③材料。熊果酸、齐墩果酸标准品（中国食品药品检定院）。1.2分析条件液相色谱条件：XRODS-Ⅲ（2.0mmI.D×75mm，1.6μm）；流动相：A－甲醇，B－纯水；流速：0.4mL·min-1；柱温：40℃；进样体积：5μL；质谱条件：扫离子模式，多反应监测（MRM），负离子扫描模式。用1μg·mL-1熊果酸和齐墩果酸标准品进行一级质谱和二级质谱扫描，并做电压优化，确定熊果酸和齐墩果酸的母离子为455.3，子离子为455.45，锥孔电压熊果酸为25V，齐墩果酸为28V，碰撞电压均为24V。1.3样品前处理1.3.1熊果酸和齐墩果酸2种不同前处理方法比较（1）方法1。取5批次怒江州泸水市老窝乡不同产地的酸木瓜鲜果，去核、粉碎，精密称定5.0g，于50mL具塞离心管中，加入50mL乙醇，70℃超声提取30min，8000r离心，取上清液过0.22μm针筒过滤头，滤液供液相色谱-串联质谱分析[4]。（2）方法2。取5批次怒江州泸水市老窝乡不同产地的酸木瓜鲜果，去核、粉碎，精密称定5.0g，于50mL具塞离心管中，加入50mL乙醇，振荡提取20min，8000r离心，将离心液转入100mL鸡心瓶，旋转蒸发到5mL，过C18固相柱（5mL甲醇，5mL水活化固相柱），用5%乙醇水冲洗小柱2次，再用6mL正己烷洗脱，收集洗脱液，50℃氮吹干，准确加入1mL初始流动相溶解，过0.22μm针筒过滤头，滤液供液相色谱-串联质谱分析。1.3.2标准溶液配制精密称定熊果酸和齐墩果酸标准品各10.0mg用甲醇定容至10mL，配成1.0mg·mL-1的母液，再用初始流动相稀释配成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2μg·mL-1标准工作液。2结果与讨论2.1标准溶液的MRM色谱图0.02ng·mL-1混合标液的MRM色谱图，如图1所示。图10.02ng·mL-1混合标液的MRM色谱图2.2标准曲线线性关系与检出限、定量限将混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定，在1.2色谱条件下依次进样测定，以待测化合物的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。该方法熊果酸的线性方程为Fx=3.9529e+007*x+104321，相关系数为0.9999386；齐墩果酸的线性方程为Fx=3.79790e+007*x+38609.2，相关系数为0.9991771。熊果酸和齐墩果酸线性范围均为0.001～0.2μg·mL-1，峰面积在该线性范围内线性关系良好。用初始流动相逐级稀释对照品混合液，在1.2色谱条件下进样，以3倍信噪比对应的溶液浓度为方法检出限，该法的熊果酸和齐墩果酸的检出限均为0.0002mg·kg-1。2.32种提取方法对结果的影响实验表明，以5号样品为例，方法1用乙醇超声提取后直接上机测定，得到的色谱峰比较杂乱，基线不平稳，待测物含量偏低。方法2用乙醇振荡提取后，旋转蒸发浓缩，过C18固相柱，正己烷洗脱、氮吹后，上机测定的结果待测物含量偏高，杂峰干扰少，基线平稳，因为浓缩、过柱能去除大分子物质和一些杂质，降低离子抑制程度，提高分析的灵敏度[5]。2种提取方法所得色谱图，分别如图2、3所示。图2方法1所得的色谱图图3方法2所得的色谱图2.4精密度试验将5号酸木瓜样品按1.2中分析条件进行重复进样6次。熊果酸（n=6）的保留时间（RSD%）为3.619%，色谱峰面积分别为2942307、2986988、2792078、2814979、2799595、2766655，平均峰面积为2851285，峰面积（n=6）的（RSD%）为2.913，齐墩果酸（n=6）的保留时间（RSD%）为3.313%，色谱峰面积分别为2663911、2591525、2539461、2572418、2536866、2506049，平均峰面积为2569431，峰面积（n=6）的（RSD%）为1.974。由此可知，该方法仪器精度良好，满足检测要求。2.5加标回收试验取5个木瓜样品，加入适量的熊果酸和齐墩果酸对照品，按1.3样品前处理方法进行样品前处理，按1.2中分析条件进行加标回收试验，熊果酸和齐墩果酸加标回收率结果如表1所示。表1熊果酸和齐墩果酸