低温乳制品中金黄色葡萄球菌检验 实时荧光PCR方法

1T/SSFSXXXX-20XX低温乳制品中金黄色葡萄球菌检验实时荧光PCR方法本文件规定了巴氏杀菌乳、高温杀菌乳（低温保存）、发酵乳、调制乳等低温乳制品中金黄色葡萄球菌的实时荧光PCR检测法（商品化试剂盒方法）。本文件适用于巴氏杀菌乳、高温杀菌乳（低温保存）、发酵乳、调制乳等低温乳制品中金黄色葡萄球菌的快速初筛及鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.1食品安全国家标准食品微生物检验总则GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验3缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1PCRPolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应。3.2实时荧光PCRRealTimePolymeraseChainReaction，实时荧光聚合酶链式反应。3.3Ct值2T/SSFSXXXX-20XXCyclethreshold，每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。4仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备如下:4.1恒温培养箱:36℃±1℃4.2电子天平:感量0.1g4.3均质器（旋刀或拍击式）或等效设备4.4pH计或精密pH试纸:精密度0.14.5微量移液器及无菌带滤芯吸头4.6金属浴:98℃±1℃4.7掌式离心机4.8实时荧光定量PCR仪4.9低温冰箱注：确证实验需要的其他仪器设备参照GB4789.10。5试剂和耗材5.17.5%氯化钠肉汤（见附录A)5.2MicroFast®金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒5.2.1裂解液管5.2.2对照管5.2.3复溶液管5.2.4试剂管（含内对照）注：确证实验需要的其他试剂和耗材参照GB4789.10。6操作流程3T/SSFSXXXX-20XX金黄色葡萄球菌检验程序见图1。图1金黄色葡萄球菌检验程序7操作步骤7.1样品制备及增菌培养将样品平衡至室温，无菌操作称取25g（mL）样品，置于盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌均质袋或其他无菌容器中，若样品是固态或半固态，用拍击式均质器拍打1min~2min混匀（或用旋转式均质器8000rpm~10000rpm均质1min~2min）；若样品是液态，不需要均质，震荡混匀即可。如使用均质袋，可直接进行培养；如使用均质杯或其他容器，无菌操作将样品转移到其他培养容器。7.2增菌将上述样品匀液内于36℃±1℃培养24h±2h，金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。留存增菌液，可保存在2℃~8℃,直至确证实验完成。4T/SSFSXXXX-20XX7.3PCR检测7.3.1模板制备将7.2中培养后的增菌液混匀后，用移液器移取40μL至MicroFast®金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒的裂解液管中（裂解液可在开盖前采用合适方式将管中液体集中至底部盖好管盖，使用金属浴加热器98℃±1℃加热10min，冷却至室温，取上清液以待检测。如无法立即检测，上清液可置于2℃~8℃保藏不超过24h。~7.3.2PCR反应体系配置金黄色葡萄球菌PCR反应体系预制在0.2mLPCR反应管中，使用前平衡至室温，加入20μL复溶液，用掌式离心机离心5s~10s，加入5μL模板，盖好管盖，使用掌式离心机离心5s~10s，即可上机检测。7.3.3PCR扩增推荐反应程序设定如下：反应体系为25μL，在第二步每个循环60℃时检测荧光信号，检测通道选择FAM、HEX。第一步第二步1个循环45个循环95℃5min7.3.4对照设置每次实验都应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照：不含有DNA酶的灭菌去离子水。阴性对照：不含金黄色葡萄球菌的样品按照检验程序进行处理后获得的核酸（试剂盒内提供）。阳性对照：金黄色葡萄球菌基因组DNA（试剂盒内提供）。内对照：包含在试剂盒反应体系中，扩增曲线对应HEX通道。7.3.5结果判定质控系统：空白对照和阴性对照均未出现典型的扩增曲线或Ct值≥40，阳性对照出现典型的扩增曲线并且Ct值＜30，且上述对照HEX通道出现典型的扩增曲线并且Ct值＜40，则检测系统正常。否则，任一种对照出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染。5T/SSFSXXXX-20XX检测系统正常的情况下，检测样品Ct值≤35时，判定PCR结果为阳性；当35＜检测样品Ct值＜40时，重复检测一次，如果Ct值＜40并且曲线有明显的对数增长期，判定PCR结果为阳性，否则判定PCR结果为阴性；当Ct值≥40或无Ct值时，判定PCR结果为阴性。如果PCR结果为阴性，且HEX通道扩增曲线正常，则直接报告阴性结果；如果PCR结果为阴性，且HEX通道扩增曲线Ct值≥40，则直接报告本次检测无效；如果PCR结果为阳性，则需要根据7.4进行确证实验。7.4确证实验PCR结果呈阳性的样品，按照GB4789.10中“5.3分离”开始进行确证实验。如不能及时进行确证实验，可将增菌液在4℃左右保存不超过72h，再进行确证。7.5可疑菌落PCR鉴定（可选）对于7.4中的典型及可疑菌落，可直接挑取菌落，加入到裂解液管中，使用金属浴加热器98℃±1℃加热10min，冷却至室温后，按照7.3进行金黄色葡萄球菌的快速鉴定。8结果与报告根据PCR检测结果及确证实验结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。6T/SSFSXXXX-20XX培养基和试剂A.17.5%氯化钠肉汤成分：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，氯化钠75g，蒸馏水1000mL。制法：将上述成分加热溶解，调节pH至7.4±0.2，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。A.2MicroFast®金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒裂解液保存于室温，复溶液及预混液保存于-20℃（复溶液尽量避免反复冻融，预混液可短期避光存放于室温）。复溶液及预混液使用前平衡至室温，向预混液管中加入20μL复溶液复溶。未复溶前试剂盒保存于-20℃,复溶后可于-20℃存放不超过14天。7T/SSFSXXXX-20XX核酸污染预防及废弃物处理实验过程中的污染防治及废弃物和扩增产物等处理可参考GB/T27403-2008《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》。8T/SSFSXXXX-20XX培养基和试剂盒的验收C.1培养基的验收参照GB4789.28《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》进行验收。C.2试剂盒的验收C.2.1工作菌株的准备参照GB4789.28《食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》准备工作菌株，至少选择一株金黄色葡萄球菌与一株大肠埃希氏菌或表皮葡萄球菌。C.2.2核酸提取参照标准文本中7.3进行。C.2.3PCR操作及结果判定参照标准文本中7.3进行。C.2.4试剂盒验收标准空白对照和阴性对照均未出现典型的扩增曲线或Ct值≥40，阳性对照出现典型的扩增曲线并且Ct值＜30，且上述对照HEX通道出现典型的扩增曲线并且Ct值＜40；同时，金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性，大肠埃希氏菌或表皮葡萄球菌的结果为阴性，本批次试剂盒合格。否则，任一种非上述正常结果，试剂盒不合格。9T/SSFSXXXX-20XX低温乳制品中金黄色葡萄球菌检验实时荧光PCR方法评价结果D.1方法的包容性、排他性对30株金黄色葡萄球菌的包容性为100%，对20株非金黄色葡萄球菌的排他性为100%。D.2方法的