QuEChERS-液相色谱串联质谱法检测畜禽肉中263 种农药残留

农药的使用对自然环境产生了不同程度的污染，通过食物链富集到动物体内，污染了动物源性食品，威胁人类健康。为保护食品安全和人类身体健康，世界各国和不少组织制定了动物源性食品中农药残留的相关检测标准和限量规定。例如，国际食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission，CAC）制定了包含动物源性食品在内的农药最高限量值（MaximumResidueLimits，MRLs）。我国也制定了《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB2763—2021），其中规定了禽肉106种、哺乳动物肉类117种农药残留的限量[1]。但存在如吡虫啉等部分农药残留没有指定检测方法，指定的检测标准大多只检测一种或一类农药残留，覆盖范围窄，检测技术不统一，甚至存在方法不适用的问题。因此，建立一个适用于畜禽肉中大部分农药残留的检测方法，有利于提高方法科学性，高效和准确地完成畜禽肉中农药残留的检测，为畜禽肉的食品安全提供更有力的技术支持和保障。动物肌肉因脂肪、蛋白质含量较高，致使其基质较为复杂，选择适当的样品前处理提取和净化方式减少农药检测过程中脂肪和蛋白质等物质的干扰，是该检测方法的重点工作。当前，农药残留检测的前处理净化方法主要有固相萃取法（GB23200.49—2016）、凝胶色谱净化法（GB/T20772—2008、GB/T19650—2006）等。现有的样品前处理净化方法虽各有优势，但也存在一些不足和局限性。例如，凝胶渗透色谱法能准确分离出农药残留组分，但需要购买贵重的前处理仪器凝胶渗透色谱仪，检测成本高、仪器操作维护烦琐、溶剂消耗量大、检测周期长。与凝胶渗透色谱法等方法相比，QuEChERS法具有检测效率高、成本低、操作简便、回收率高、环境友好等优势[2]，已在禽肉、禽蛋、牛奶、淡水鱼等动物源性食品中农药残留检测采用[3-9]。因此，本实验选择QuEChERS法对畜禽肉中农药残留进行前处理。农药残留的仪器检测技术主要有气相色谱（GasChromatography，GC）、液相色谱（LiquidChromatography，LC）、气相色谱质谱（GasChromatography-MassSpectrometry，GC-MS）、气相色谱串联质谱（GasChromatography-TandemMassSpectrometry，GC-MS/MS）、液相色谱串联质谱（LiquidChromatography-TandemMassSpectrometry，LC-MS/MS）等。其中，GC检测范围有限，不利于挥发性小、热稳定性差、分子质量大的样品检测。LC易受复杂基质干扰，检测农药种类少，灵敏度低。GC-MS不能进行二级质谱扫描，抗干扰能力较差。较之上述方法，MS/MS增加了二级子离子的质谱信息，采用离子对及其比值进行定性分析，目标化合物色谱图不分离也能进行定性定量。其多反应监测模式具有较高灵敏度和抗干扰能力，分析结果准确可靠，适用于痕量农药残留的检测。因此，本实验基于QuEChERS前处理方法，建立一种可同时检测畜禽肉中263种农药残留的LC-MS/MS方法。该方法的建立可以满足客户对肉类食品原料筛选、产品质量及出口监控等需求，为我国畜禽肉食品中农药残留的快速检测以及食品安全监管提供科学技术支持。1材料与方法1.1仪器与试剂Agilent1290-G6470高效液相色谱-三重串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源；TGL-16M型台式高速冷冻离心机；BRAUN-3205型博朗料理机；KQ-500DB型超声波清洗器；DMT-2500型多管旋涡混合仪；YP502型电子天平；0.22μm微孔滤膜；实验用水为一级水；正己烷、丙酮、乙腈、乙酸铵、甲酸、乙酸，均为色谱纯；QuEChERS萃取盐包［6g无水硫酸镁（MgSO4）、1.5g醋酸钠（NaOAc）］；QuEChERS净化包［900mg无水硫酸镁（MgSO4）、150mgN－丙基乙二胺（PSA）、150mg十八烷基硅烷（C18）］；263种农药及其代谢物（10mg·L-1），均购于北京曼哈格生物科技有限公司；实验用猪肉、鸡肉、羊肉，均为市面随机购买。1.2实验方法1.2.1样品前处理样品用绞肉机绞碎，充分混匀，准确称取5g样品（精确至0.01g），置于50mL离心管中，加入5mL水浸泡后，涡旋振荡3min，准确加10mL乙腈，涡旋振荡3min，加QuEChERS萃取盐包（1.5g醋酸钠+6g无水硫酸镁）涡匀，涡旋振荡10min提取，2800r·min-1冷冻离心3min，然后取上清液经QuEChERS净化包（900mg无水硫酸镁、150mgN－丙基乙二胺、150mg十八烷基硅烷）净化后，过0.22μm微孔针式过滤器后上机检测。1.2.2标液配制分别吸取一定量的10mg·L-1混标储备溶液，用乙腈定容至10mL，配制成1.00mg·L-1的混合标准溶液，于-18℃下避光、密封保存。取空白样品，按照上述前处理方法处理成空白基质液，配制基质曲线浓度为5μg·L-1、10μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1和200μg·L-1的基质标准工作溶液。1.2.3仪器测定条件色谱条件：ZORBAXEclipseC18柱（2.1mm×50mm，1.8μm）；流速：0.300mL·min-1；进样量：5.0μL；柱温：30℃。流动相：0.1%甲酸的0.005mol·L-1乙酸铵溶液（A）和甲醇（B）；梯度洗脱程序见表1。表1洗脱程序表质谱条件：离子模式（ESI+、ESI-）；多反应监测模式（MRM）；气流速：3mL·min-1；离子源温度：300℃；雾化气、鞘气和碰撞气为普通氮气，使用前调节各气体流量使质谱灵敏度达到检测要求。2结果与分析2.1色谱及质谱条件的选择优化配制含有263种农药的200μg·L-1的标准溶液，参考GB23200.121—2021中农药的母离子和子离子等质谱信息，分别在正离子模式和负离子模式下，找出适用于本质谱仪器的最优裂解电压和碰撞电压。在相同实验条件下分别将乙腈和甲醇作为有机相进行对比。实验表明，甲醇为有机相时大部分农药的峰形、响应优于乙腈，故选择甲醇为有机相。水相中添加甲酸和乙酸铵能提高电喷雾离子化的离子响应强度，因此考察水相中添加不同浓度的甲酸（0.01%、0.10%）、乙酸铵（2mmol·L-1、5mmol·L-1）对峰形、响应值的影响。经实验比较，添加含0.1%甲酸的5mmol·L-1乙酸铵水溶液时，目标农药的响应值高、峰形好。因此最终确定流动相的条件为含0.1%甲酸的5mmol·L-1乙酸铵水溶液－甲醇作为流动相进行梯度洗脱，保留时间见表2。表2263种农药的保留时间表单位：min2.2提取溶剂的选择结合动物肌肉中脂肪、蛋白质含量高的特点以及各目标农药残留的特性，分别采用乙腈、1%乙酸乙腈、正己烷∶丙酮（1∶1）、饱和正己烷的乙腈溶液作为样品提取溶剂。分别向空白基质中添加100μg·kg-1混合农药标准溶液，在其他实验条件相同情况下，通过回收率比较4种不同提取剂的提取效果。由表3可知，乙腈、饱和正己烷的乙腈溶液、1%乙酸乙腈在猪肉、鸡肉、羊肉3种基质中均呈现出较佳的提取效果。其中，乙腈效果最好。本实验选择乙腈为最终提取溶剂。表3不同提取溶剂对263种农药的添加回收率统计表单位：种2.3方法的线性范围及定量限由加标回收实验可知，263种农药在实验基质中都呈现出基质增强效应。本方法采用空白基质溶液配制标准曲线，减小基质效应对定量结果的影响。取未检出农药残留的猪肉、鸡肉、羊肉，按照前处理方法处理成空白基质液，配制曲线浓度为5μg·L-1、10μg·L-1、50μg·L-1、100μg·L-1和200μg·L-1的基质标准工作溶液。以峰面积对浓度分别绘制标准曲线，在5～200μg·L-1的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99。往空白样品中添加0.010mg·kg-1浓度水平的混合标准溶液，前处理后上机检测，平行测定6份。得263种农药的信噪比均大于10，确定定量限为0.010mg·kg-1。2.4准确度及精密度以空白猪肉、鸡肉、羊肉加标的回收率表示方法的准确度，以回收率的相对标准偏差（RSD）表示方法的精密度。分别在阴性样品中加入10μg·kg-1、20μg·kg-1和50μg·kg-13个水平混合标准溶液，每个浓度重复测定6次，平均加标回收率在60.6%～119.1%，精密度（RSD）小于15%，见表4。该方法具有良好的精密度和准确度，能够满足畜禽肉中多种农药残留的检测要求。表4263种农药的加标回收率及精密度表（n=6）3结论本实验建立了QuEChERS-液相色谱串联质谱法对畜禽肉中多种农药残留定性