一种可快速检测大肠杆菌O157：H7 的纸基传感器的制备与应用

食源性致病菌是引发公共卫生安全事件的重要因素之一，其在食品的制造、销售、处理和消费等过程中都有传播的可能性[1]。在食源性致病菌中，大肠埃希氏菌是易导致出血性腹泻和肠炎的致病菌，O157:H7则是典型的菌属，该致病菌通常存在于未经加工的蔬菜、肉制品中，若摄入被大肠杆菌O157:H7污染的食品，会对人体造成较大伤害[2]，因此需要建立一类适用于现场快速检测的方法来对食品进行筛查，尽量减少致病菌带来的危害。大肠杆菌O157:H7的检测方法有传统的培养法、分子生物学检测、免疫学方法[3]、生物传感器法和核酸适配体法等。传统的检测方法的检测周期长、对检测人员经验要求高，免疫学和分子生物学检测方法的操作复杂、无法满足现场快速检测的要求，因此如何在低成本、高效、快速的前提下进行检测成为亟待解决的问题。本研究制备了一种基于适配体的快速检测纸基传感器，用于大肠杆菌O157:H7的检测。该传感器有较好的特异性和重复性，可在15min内快速检测出大肠杆菌O157:H7并应用于实际样品检测中。1材料与方法1.1材料与试剂硝酸镓；99.99%六水合硝酸锌；硝酸铬；氨水（28wt%）；盐酸；异丙醇；氢氧化钠；超纯水；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；N-羟基丁二酰亚胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；无水乙醇；羟基化聚乙二醇羧酸（HO-PEG12-COOH）；PBS缓冲液（0.01mol·L-1，pH=7.4）；Tris-HCl缓冲液（10mmol·L-1，pH=7.2）；功能化核酸适配体及其互补序列；whatman1号定性滤纸；吸水棉；底板；大肠埃希氏菌O157:H7（ATCC35150）；麦氏比浊管；琼脂平板。1.2仪器设备CP-225D天平，德国赛多利斯；便携式pH计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；XPDHG-9246A数显鼓风干燥箱，上海析谱仪器有限公司；马弗炉，英国CARBOLITE；DF-101S集热式磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；MilliqAcademic超纯水机，美国密理博公司；KQ-50E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；水热反应釜，力辰科技；TG-16离心机，上海屹谱；TalosF200透射电子显微镜，赛默飞；D8ADVANCEX射线衍射仪，布鲁克AXS；RF-6000荧光分光光度计，日本岛津公司；Zeta电位分析仪，PALS美国布鲁克公司；WFH-204B手提式紫外分析仪，杭州齐威仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1材料合成本文采用一步水热法[4]合成红色长余辉纳米材料ZnGa2O4:Cr3+，首先用超纯水分别配制2mol·L-1硝酸镓、1mol·L-1硝酸锌、1mmol·L-1硝酸铬溶液，再移取1mL硝酸镓、2mL硝酸锌、4mL硝酸铬的水溶液于烧杯中混合均匀，加超纯水定容至30mL，定容过程中用氨水调节溶液pH至9.0。随后，将混合溶液于室温搅拌0.5h使其预反应，预反应结束后将溶液转移到聚四氟乙烯内衬反应釜（内衬体积50mL）中，封好后将反应釜放入220℃烘箱中（事先预热），水热反应约10h。反应结束后，待反应釜自然冷却到室温，将产物分散于0.01mol·L-1盐酸中，充分混合后离心收集，加入过量异丙醇离心洗涤3次，最后用超纯水洗涤1次，于真空干燥箱中干燥备用。1.3.2适配体选择参考文献[5]合成修饰过的大肠杆菌O157:H7适配体及DNA互补链，用以修饰长余辉材料的适配体的5'端均修饰了羧基，3'端修饰了生物素，其余适配体5'端均用生物素进行了修饰，所有适配体和DNA互补链均委托上海生工生物工程有限公司合成，所合成的DNA序列见表1。表1适配体或DNA序列表1.3.3适配体功能化材料（1）羟基化修饰。将200mg红色长余辉纳米材料放入5mmol·L-1氢氧化钠溶液中并超声分散，在室温条件下搅拌24h，而后放入离心机中2700r·min-1离心分离5min，将离心产物依次用超纯水（自制）洗涤3次，洗涤所得产物于真空干燥箱中，在10-2Pa、50℃条件下干燥6h，收集备用。（2）氨基化修饰。取羟基化的红色长余辉材料100mg，超声分散于40mLDMF中，边磁力搅拌边向溶液中加入APTES，加入量约为40μL；滴加结束后将其置于80℃下恒温搅拌12h，2700r·min-1离心3min，分离收集底部沉淀；用DMF洗涤沉淀3次，无水乙醇洗涤2次，最终产物在室温下真空干燥。（3）适配体功能化长余辉纳米探针。通过酰胺缩合反应实现长余辉纳米颗粒与核酸适配体的偶联。具体方法是将5mg氨基功能化的长余辉纳米材料与4nmol的5'端修饰了COOH和3'端修饰了生物素的大肠杆菌O157:H7的适配体1、8nmol的NHS、16nmol的EDC混合于0.01mol·L-1的PBS溶液（pH在7.4左右）中，室温下避光搅拌。接着将4μmol的HO-PEG12-COOH、8μmol的NHS、16μmol的EDC加入上述溶液中，于室温下避光搅拌反应8h，3000r·min-1离心5min以分离除去未反应的适配体，将沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH=7.2）洗涤3次即可得到适配体功能化的长余辉纳米颗粒，再将其置于缓冲溶液中分散存储备用。（4）材料表征。将长余辉材料粉末置于X射线衍射仪中扫描获取XRD图谱，将长余辉材料极少量分散于水溶液中进行超声，再放入荧光分光光度计测得激发光谱和发射光谱，将固体粉末和水溶液分别放于紫外灯254nm条件下照射，可观察到荧光现象。将功能化修饰前后的长余辉材料分散于纯水中，然后置于Zeta电位分析仪中测得材料的电位变化。1.3.4纸基传感器的制作将whatman1号定性滤纸裁剪成如图1所示形状，滤纸分成同等大小的3份并进行折叠（图2），用3对圆形超强磁铁将3层滤纸吸附住进行部分封闭，将折叠好的滤纸放入加热融化的石蜡液中，浸没后立刻取出，待冷却后将滤纸放入烘箱低温加热使石蜡均匀渗透到滤纸间隙中。如图1所示，圆形区域未被石蜡浸润的为亲水区，其余已被石蜡浸透的部分为疏水区。将3mg·mL-1适配体1功能化的长余辉探针固定在第一层的亲水区，4nmol·L-1适配体2固定在第二层的亲水区，7nmol·mL-1适配体1的DNA互补链固定在第三层的亲水区，固定结束后将纸基置于37℃烘箱内加热8h，在最后一层底部粘合吸水垫和底板，最后密封干燥保存。检测原理如下。当溶液中含有大肠杆菌O157:H7时，目标致病菌与功能化的长余辉探针结合进入第二层，第二层的适配体2又与目标致病菌相结合，未结合的长余辉探针则随着毛细作用进入第三层与适配体1的DNA互补链相结合，待反应结束后在紫外灯254nm下照射激发纸基，则第二层与第三层均有红色荧光；若溶液中不含目标致病菌，则长余辉探针直接与第三层的适配体1DNA互补相结合，紫外灯激发后第二层无荧光现象，第三层有红色荧光。图1滤纸展开形状图图2滤纸折叠方式图1.3.5致病菌检测对购买的标准菌株大肠杆菌O157:H7进行活化，在培养基中37℃培养24h，用接种环取适量细菌于透明玻璃管中，摇匀后与麦氏比浊管进行比对，配制成109CFU·mL-1浓度的菌液，而后将菌液稀释，摇匀后吸取1mL菌液置于培养基中，37℃培养24～48h，用平板计数法来确定细菌的浓度。将不同浓度的菌液滴加进第一层亲水区，向下渗透一段时间后，用紫外灯照射不同的检测层以观察荧光现象确定检测结果，并将其与无菌水样品检测结果进行对照。2结果与分析2.1材料结构表征由图3可知，将X射线衍射仪所得材料图谱与标准图谱JCPDS：86-0415对比可知，所有衍射峰均与标准图谱相符合，这表明所制备的红色长余辉纳米材料具有典型的ZnGa2O4晶相结构。由图4可知，纳米粒子的平均粒径为8.6nm，尺寸差别较小，颗粒呈不规则状，近圆形，分散性较好。图3ZnGa2O4:Cr3+长余辉材料的XRD图谱图4ZnGa2O4:Cr3+在透射电镜下的形貌特征图2.2光学特性表征由图5可知，合成的红色长余辉纳米材料可在217～298nm的紫外光条件下激发；由图6可知，该材料在发射峰684nm处，处于红色光区域。由图7可知，用手提式紫外分析仪在254nm条件下照射超声后的长余辉纳米粒子溶液，可见溶液呈现明显的红色。图5ZnGa2O4:Cr3+的激发光谱图图6ZnGa2O4:Cr3+的发射光谱图图7红色长余辉材料固体粉末和水溶液在紫外灯激发后的余辉现象图2.3适配体功能化由图8可知，对长余辉材料（PLNPs）、氨基化的长余辉材料（PLNPs-NH2）、与适配体连接的长余辉材料（PLNPs-适配体1）分别进行ζ电位的测定，氨基功能化后的长余辉材料ζ电位由+6.29mV增加到+10.86mV，而与适配体连接后的ζ电位则减少到-12.93mV，此时纳米颗粒带少量负电荷，证明纳米材料适配体功能化成功。图8长余辉材料功能化修饰前后ζ电位的变化图2.4菌液验证将7种不同浓度的菌液分别滴加到纸基传感器，15min后用紫外灯照射观察。菌液的浓度依次为7.5×106CFU·mL-1、7.5×105CFU·mL-1、7.5×104CFU·mL-1、7.5×103CFU·mL-1、7.5×102CFU·mL-1、7.5×101CFU·mL-1、0CFU·mL-1，当菌液浓度大于等于7.5×103CFU·mL-1时，传感器第二层和第三层均能看到明显的红色荧光，当菌液浓度小于7.5×103CFU·mL-1时，传感器第二层无荧光现象，第三层仍有明显的红色荧光。这表明此传感器最小检出浓度为7.5×103CFU·mL-1。用纸基传感器对浓度为104CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌菌液、7.5×103CFU·mL-1的大肠杆菌O157:H7和104CFU·mL-1的金黄色葡萄球菌的混合液分别进行检测。由图9可知，滴加金黄色葡萄球菌菌液的传感器只有第三层有红色荧光，而滴加混合菌液的传感器第二