动物源性食品中金刚烷胺的检测 量子点微球荧光免疫层析法

1DBXX/XXXXX—XXXX动物源性食品中金刚烷胺的检测量子点微球荧光免疫层析法本文件规定了动物源性食品中金刚烷胺残留量的量子点微球荧光免疫层析检测方法。本文件适用于鸡肉、鸡蛋和猪肉中金刚烷胺的快速检测。本方法检测金刚烷胺的检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB31650食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27417合格评定化学分析方法确认和验证指南3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理本方法以量子点微球为荧光标记物，基于竞争抑制免疫层析技术原理，通过荧光信号读取仪进行数据读取和分析，根据已设定的标准曲线计算样品中待测物质的含量，对动物源性食品中金刚烷胺进行半定量或定量检测。5试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯5.1水：应符合GB/T6682，二级水。5.2金刚烷胺标准物质：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.3甲醇（CH3OH）。5.4乙酸乙酯(CH3COOC2H5)。5.5正己烷(C6H14)。5.6二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）。5.7十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）。2DBXX/XXXXX—XXXX5.8氯化钠（NaCl）。5.9磷酸二氢钾（KH2PO4）。5.10氯化钾（KCl）。5.11盐酸（HCl）。5.12氢氧化钠（NaOH）。5.13样本提取剂A：称取8.0g氯化钠（5.8）、0.2g磷酸二氢钾（5.9）、0.2g氯化钾（5.10）、2.9g定容至1L。5.14样本提取剂B：称取20.0g氢氧化钠（5.12），加入约900mL水（5.1）溶解混匀，定容至1L。5.15样本复溶液磷酸盐缓冲液（10mmol/L，pH7.4）：称取8.0g氯化钠（5.8）、2.77g十二水合磷酸氢二钠（5.7）、0.352g二水合磷酸二氢钠（5.6），用水（5.1）溶解并定容至1L。5.16金刚烷胺标准品储备液（100μg/mL）：准确称取10mg（精确至0.01mg）金刚烷胺（5.2）于烧杯中，用甲醇（5.3）溶解后转移至100mL容量瓶中，用甲醇（5.3）稀释至刻度，摇匀。-20℃冷冻避光保存，有效期3个月。6仪器和设备6.1分析天平：感量分别为0.01g和0.01mg。6.2微量移液器：20～200µL、100～1000µL和1～10mL。6.3旋涡混合器：转速≥2500r/min。6.4恒温孵育器：设定温度误差不超过±1度。6.5荧光免疫分析仪：激发波长为365±5nm，发射波长为610±5nm。6.6样品浓缩仪：设定温度误差不超过±1度。6.7搅碎机：转速≥5000r/min。6.8离心管：1.5mL和50mL。6.9金刚烷胺量子点微球荧光免疫层析快速检测试剂盒（一般含检测卡和ID卡，内设对应批次标准曲7试样制备7.1试样准备称取约200g具有代表性的禽肉组织样品，充分均质混匀，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。留样置于-20℃保存。7.2试样前处理3DBXX/XXXXX—XXXX7.2.1准确称取试样2g（精确至0.01g）均质样本于50mL离心管中。7.2.2加入2mL样本提取剂A（5.13），涡旋振荡2min，加入1mL样本提取剂B（5.14），涡旋振荡30s，最后加入4mL乙酸乙酯（5.4），手动振荡混匀30s，静置1min，待溶液分层。7.2.3准确吸取2mL上清液于10mL离心管中，于65℃用样品浓缩仪（6.6）吹干。7.2.4加入1mL正己烷（5.5），完全溶解后再加入500μL样本复溶液（5.15），轻轻颠倒混匀，确保离心管壁上的残留均能被样本复溶液混匀（请勿振荡）。7.2.5静置1min，溶液分层后吸取下层液体用于检测。注：不同厂家检测卡所用的样品前处理方法可能不同，应按照产品使用说明中8检测步骤8.1测试前打开荧光免疫分析仪（6.5确认试剂盒中的ID卡与试剂盒的批号是否匹配后插入ID卡，在仪器测试界面点击“读ID卡/读项目”，界面出现“读取完成”，点击“确认”即可使用。8.2将恒温孵育器（6.4）开机，待温度升至37℃即可使用。8.3从包装铝箔袋中取出检测卡，在半小时内使用。8.4将检测卡平放，用微量移液器吸取90μL稀释后的待测液于检测卡的加样孔（S）中，在恒温孵育器中37℃孵育反应10min。8.5反应时间结束后立即将检测卡插入读取仪中，点击仪器界面的“测试”，仪器会自动给出定量测试结果，15min后测试无效。注：不同厂家读卡仪所用仪器界面设置可能不同，应按照仪器使用说9结果表述样品中金刚烷胺的含量由荧光分析仪自动计算并显示，单位为微克/千克(μg/kg）。本方法参比标准为GB31660.5《食品安全国家标准动物性食品中金刚烷胺残留量的测定液相色谱-串联质谱法》。4DBXX/XXXXX—XXXX（资料性）产品性能指标计算A.1检出限和定量限通过对20个独立的空白样品进行测定，检出限以空白样品20次测定结果的均值加3倍标准偏差计算；定量限以空白样品20次测定结果的均值加10倍标准偏差计算。A.2准确度综合考虑目标分析物国家标准限量值或禁用目标分析物的参比方法定量限，制备低、中、高三个浓度水平的盲样，每个浓度水平进行至少6次重复实验。三个浓度水平的平均加标回收率应在70-130%（需讨论确定）。A.3重复性采用三批验证产品进行检测，每批至少6次重复测定中等浓度水平的样品，相对标准偏差（RSD）应小于15%。A.4特异性目标分析物及其结构类似物的标准品用缓冲液配制成系列梯度浓度，做出标准曲线，得出IC50（半抑制浓度）后按照式（1）计算交叉反应率。A.5